賀愛蘭，張夢成，彭東海

(1.湖南人文科技學(xué)院生命科學(xué)系，湖南 婁底417001;2.湖南人文科技學(xué)院 計(jì)算機(jī)系，湖南婁底417001)

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，其患病率占女性惡性腫瘤的第一位。全世界每年約有新發(fā)女性乳腺癌患者120萬，去年因乳腺癌死亡者約46.5萬人。盡管對(duì)乳腺癌的治療探索己有100多年的歷史，迄今為止，乳腺癌的病因及其惡性進(jìn)展的具體機(jī)制尚未完全闡明。與其他惡性腫瘤一樣乳腺癌其形成與發(fā)展是多步驟漸進(jìn)、多種因素綜合作用的結(jié)果。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的一個(gè)主要原因，浸潤和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與、多步驟進(jìn)行及多階段發(fā)展的過程。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，一種新的途徑引起人們的關(guān)注，即:泛素 (ubiquitin)系統(tǒng)。隨著人們對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)一步的了解，泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑在腫瘤發(fā)生中的重要性也越來越顯著，并且逐漸成為腫瘤治療的主要靶點(diǎn)之一。

UFC1的全名為“ubiquitin－fold modifier conjugating enzyme 1”是一個(gè)新鑒定的類似泛素結(jié)合酶E2。Ufc1的功能是 Ufm1(ubiquitin－fold modifier 1)結(jié)合酶，其活性位點(diǎn)是Cys116。Ufm1(ubiquitin－fold modifier 1)是一種類泛素修飾因子，通過 Uba5(E1)和 Ufc1(E2)共價(jià)結(jié)合到靶蛋白上。目前，對(duì)UFC1的功能研究報(bào)道還比較少，有待更進(jìn)一步的研究和探討。UFC1在泛素系統(tǒng)中的作用越來越引起人們的重視，但對(duì)于UFC1在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制的研究還未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

T4 DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa，總 RNA提取的 TRIZOL 試劑購自 Invitrogen，，MCF7，HBL100，MDA－MB231，MDA－MB－453細(xì)胞系由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

一系列的乳腺細(xì)胞(MCF7，HBL100，MDA －MB231，MDA－MB－453細(xì)胞系)在37℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液(補(bǔ)加10%新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺和100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素).

1.2.2 總RNA的提取

當(dāng)細(xì)胞長至90%，收集細(xì)胞，用PBS洗一次，800 rpm離心5 min，去上清;加入TRIZOL 1 mL，吹打混勻，置室溫10 min;加氯仿 0.2 mL 振蕩 15 s，置室溫 5 min;4°C，10000 rpm離心10 min;仔細(xì)吸取上層水相，移至另一離心管，勿吸動(dòng)中間蛋白相;加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻，－20°C放置2 h或過夜;4°C，10000 rpm離心10 min，棄上層液相;加冷凍75%乙醇(0.1%DEPC水配制)1 mL，充分洗滌沉淀，4°C，5000 rpm離心5 min;棄上清，置于空氣中15－20 min，沉淀溶于0.1%DEPC水;將細(xì)胞中提取的RNA各取2 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。

1.2.3 半定量RT－ PCR 分析

分別取各細(xì)胞系中所提取的總 RNA 2μg，按Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄20μL反應(yīng)體系，合成cDNA。再以逆轉(zhuǎn)錄后的反應(yīng)液2μL作為模板，對(duì)UFC1基因的表達(dá)進(jìn)行半定量RT－PCR分析，PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。引物序列如下:UFC1正義鏈:5'－ GATCGTGAGTTGTGGGTGCA －3'，反義鏈:5'－ TGTTGGATGACGCCCTTCTG －3'(413bp);β－actin正義鏈:5'－GCGCGGCTACAGCTTCA －3'，反義鏈:5'－ CTTAATGTCACGCACGAT TTCC －3'(68bp)。PCR條件:94℃變性3分鐘;94℃1分鐘，60℃30秒，72℃30秒，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10分鐘，4℃保存。1.2%瓊脂糖電泳，用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照并使用圖像分析軟件(Image J)分析同一樣本UFC1基因與β－actin PCR產(chǎn)物條帶的吸光度，計(jì)算UFC1條帶與β－actin條帶吸光度比值〔UFC1 mRNA指數(shù)=UFC1吸光度值/β－actin吸光度值〕，對(duì)UFC1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 一系列的乳腺細(xì)胞系中的總RNA的提取

培養(yǎng)一系列的乳腺細(xì)胞(MCF7，HBL100，MDAMB231，MDA－MB－453細(xì)胞系)于10 cm皿中，當(dāng)細(xì)胞長至90%，收集細(xì)胞，按照試劑說明書，用TRIZOL(Invitrogen，U.S.A.)提取RNA;將細(xì)胞中提取的RNA 各取2μL 進(jìn)行瓊脂糖電泳，可以觀察到清晰的28 S、18 S、5 S條帶(圖1)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明RNA的提取效果理想，然后檢測各RNA的OD260/280值，其OD260/280值都在1.85左右，說明提取的RNA有著較高的濃度(圖1).

圖1 在一系列的乳腺細(xì)胞系中提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 UFC1在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)譜

用半定量RT－PCR的方法來檢測UFC1在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)情況，電泳結(jié)果顯示(圖2)，各組內(nèi)參β－actin條帶亮度相似，UFC1基因在HBL100乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)最高，而在乳腺癌細(xì)胞系MCF7，MDA－MB231，MDA－MB－453中的表達(dá)明顯降低，并且在乳腺癌細(xì)胞MDA－MB－453中的表達(dá)量最低。UFC1 mRNA指數(shù)〔UFC1吸光度值/β－actin吸光度值〕在HBL100細(xì)胞系中為11.7，MDAMB－453細(xì)胞系中為0.1，MDA －MB231細(xì)胞系中為0.7，MCF7細(xì)胞系中為0.8。在實(shí)驗(yàn)過程中，目的基因UFC1和內(nèi)參β－actin在瓊脂糖電泳后都只有單一的一條帶，說明兩個(gè)基因都是特異性的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)沒有污染。

圖2 用半定量RT－PCR檢測一系列的乳腺細(xì)胞系中UFC1 mRNA的表達(dá)

3 討論

目前對(duì)蛋白質(zhì)泛素化降解途徑與腫瘤發(fā)生的關(guān)系方面的研究取得了長足的進(jìn)步［1－2］，但是對(duì)于UFC1在泛素系統(tǒng)中的功能研究報(bào)道還比較少，有待更進(jìn)一步的研究和探討。UFC1在泛素系統(tǒng)中的作用越來越引起人們的重視［3－5］，但對(duì)于UFC1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況及其相關(guān)性的研究還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以UFC1為研究對(duì)象，采用半定量RT－PCR檢測方法，發(fā)現(xiàn)UFC1在一系列的乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)不同(圖2):在正常的HBL100乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)最高，而在乳腺癌細(xì)胞系MCF7，MDA－MB231，MDA－MB－453中的表達(dá)明顯降低。先前用real－time RT－PCR檢測到UFC1在多數(shù)乳腺癌組織中低表達(dá)，而在正常的乳腺組織或者癌旁組織中，UFC1的相對(duì)表達(dá)量要高，同時(shí)也檢測到 IFITM2，LY6E在多數(shù)乳腺癌組織中是高表達(dá)。IFITM2屬于干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白家族，編碼一細(xì)胞表面蛋白，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞粘連、影響細(xì)胞分化［6］。Andreu等人認(rèn)為IFITM家族是人結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物［7］。他們還發(fā)現(xiàn)在IFITM mRNA水平上，乳腺癌與正常乳腺組織之間沒有差異。但是其IFITM cDNA探針檢測的是整個(gè)IFITM家族，所以并不能說明IFITM2在乳腺癌中沒有異常表達(dá)。在我們的研究中，IFITM2和乳腺腫瘤是有一定關(guān)聯(lián)的。Ly6e(RIG－E)跟細(xì)胞信號(hào)途徑以及細(xì)胞粘連有關(guān)。它定位于小鼠第15號(hào)染色體(41.7cm)，在該區(qū)域發(fā)生遺傳改變和淋巴瘤有關(guān)，原癌基因c－sis和c－myc也定位于該區(qū)域，不過在肝癌中其表達(dá)低于正常肝組織［8］。在乳腺癌細(xì)胞里，雌激素能夠調(diào)節(jié)Ly6e的表達(dá)［9－10］，以往的研究還沒有證據(jù)顯示它和乳腺癌有直接的關(guān)系。

不同的乳腺細(xì)胞系和組織間的UFC1表達(dá)情況表明:UFC1的差異表達(dá)與乳腺癌之間有著相關(guān)性，為將UFC1作為新的靶分子引入腫瘤的臨床預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。當(dāng)然，還需要觀察UFC1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長情況的影響，探討UFC1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及可能的分子機(jī)制，我們也正在開展這方面的工作。這樣，對(duì)于闡明人體乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為乳腺癌預(yù)防和治療的研究提供一些有力的理論根據(jù)，這是降低乳腺癌高發(fā)病率和高死亡率的有效途徑。

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