鄧桂馨，許尚忠，高 雪，李俊雅，高會江，袁崢嶸，周正奎，黃 萌，李 姣

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094）

牛CTSB基因第6內(nèi)含子SNP與經(jīng)濟性狀的關聯(lián)分析

鄧桂馨，許尚忠，高 雪，李俊雅，高會江，袁崢嶸，周正奎，黃 萌，李 姣

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094）

以174頭西門塔爾牛和魯西黃牛的雜交后代作為試驗動物，利用PCR-RFLP方法對組織蛋白酶B基因（cathepsin B，CTSB）內(nèi)含子6進行多態(tài)性檢測，并應用SAS軟件采用最小二乘法擬合線性模型，對不同基因型與牛部分經(jīng)濟性狀進行關聯(lián)分析。結(jié)果表明，CTSB基因內(nèi)含子6的T5357C位點與大理石紋和活重2個經(jīng)濟性狀顯著相關，其中AA型大理石紋評分顯著地高于BB型（P＜0.05），BB型活重顯著高于AA型（P＜0.05）。上述結(jié)果為T5357C作為肉牛部分經(jīng)濟性狀的分子標記提供了一定的理論依據(jù)。

牛；CTSB基因；肉質(zhì)性狀；胴體性狀

為滿足市場對高檔牛肉消費需求的持續(xù)增長，加快肉牛育種業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟性狀的分子標記輔助選擇技術(shù)日益得到廣泛應用。溶酶體組織蛋白酶（lysosomes cathepsin）家族基因是胴體和肉質(zhì)性狀研究的熱點之一。組織蛋白酶 B、C、K、L、M、N和S等屬于半胱氨酸蛋白酶;組織蛋白酶A、G和R屬于絲氨酸蛋白酶;組織蛋白酶D和E屬于天冬氨酸蛋白酶［1］，其中組織蛋白酶B和酶D、H及L是引起宰后肌肉降解的主要酶類［2］。組織蛋白酶B是目前研究最多，了解最透徹的溶酶體硫醇蛋白酶。該酶最早分別是從鯉魚、灰鯔魚、羅非魚和鯖魚中提純得到的，分子量23～29 kDa。研究表明，鯉魚組織蛋白酶B能降解肌肉肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和肌鈣蛋白T（TN-T），但對原肌球蛋白不起作用。此后，在20世紀70年代，鼠CTSB基因的結(jié)構(gòu)得到了鑒定。比較研究發(fā)現(xiàn)，不同種動物的CTSB基因的結(jié)構(gòu)非常相似。鼠CTSB基因已被定位于14號染色體［3］，其基因組DNA由10個外顯子（exon）、9 個內(nèi)含子（intron）組成。Dong等［4］首次報道了禽的CTSB基因序列，該基因編碼序列DNA序列全長為1 023 bp，共編碼340個氨基酸。Russo V等發(fā)現(xiàn)CTSB 基因與豬背膘厚呈顯著相關［5］。Huang和 Tappel［6］認為CTSD酶是與宰后嫩化有關的組織蛋白酶中最重要的酶之一。V Russo等將豬CTSD定位于第2號染色體，位于生長、肉質(zhì)、胴體性狀綜合QTL區(qū)域，并與部分性狀呈顯著相關［7］。

1 材料與方法

1.1 試驗牛來源及采樣方法 以河北華安肉牛場174頭西門塔爾?！留斘鼽S牛雜交后代群體作為試驗動物群，該群牛全部為20～36月齡的閹牛。從頸靜脈采血，采用ACD抗凝，4℃運輸，至實驗室后保存于-20℃冰箱。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa），PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ等均購自Promega公司。

1.3 DNA提取 采用常規(guī)酚-氯仿法抽提基因組DNA。應用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度并估計含量，稀釋至50 ng/μL。

1.4 引物設計以及PCR反應條件 根據(jù)Genbank公布的CTSB基因序列（NC_007306），應用Primer 5.0軟件設計引物，由基諾來普生物技術(shù)公司合成。P1：5’GGTTGCAGACCGTACTCC 3’，P2 ：5’CACCAGACTTG －TATAGCAGGA 3’。反應條件：95℃5min；94 ℃ 30 s，62℃30 s，72 ℃ 30 s，33 個循環(huán)；72 ℃ 10 s。反應體系為 20μL：50 ng of DNA template，10 pM 引物，0.20 mM dNTP，2.5 mM MgCl2，0.5 u Taq酶。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.5 PCR-RFLP分型 PCR產(chǎn)物酶切選用HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ進行酶切，只有AciⅠ酶切產(chǎn)物呈多態(tài)。37℃，12 h，消化產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠檢測，照相統(tǒng)計分型。

1.6 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計基因型，計算等位基因和基因型頻率，并進行哈代-溫伯格平衡和多態(tài)信息含量檢驗。

運用SAS9.2中的GLM過程中的最小二乘均方Tukey’s檢驗對經(jīng)濟性狀與基因型之間進行關聯(lián)分析。在模型中包括基因型效應和年齡效應（包含品種及組效應），統(tǒng)計模型如下：

其中，Yijk為經(jīng)濟性狀觀察值，μ為總體均值，Gi為第i個基因型固定效應，Mj為第j個體的體重（宰前活重分析時去除），作為協(xié)變量，eijk為隨機殘差效應。結(jié)果用最小二乘平均值±標準誤表示（LSM±SE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增 圖1是應用引物P1、P2對CTSB基因內(nèi)含子6進行的擴增，擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測，從檢驗結(jié)果來看PCR產(chǎn)物特異性良好，擴增效率較高，滿足進一步酶切的需要。

圖1 CTSB基因intron6（653bp）的擴增產(chǎn)物

2.2 酶切結(jié)果 實驗選用HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ中限制酶進行酶切，只有AciⅠ酶切后產(chǎn)生3種基因型，純合子AA、BB和雜合子AB。見圖2。

2.3 基因和基因型頻率 由表1可以看出：B等位基因的頻率為0.65，明顯高于A等位基因的頻率0.35，表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。

圖2 CTSB intron6酶切圖譜

表1 突變位點基因型頻率和基因頻率

由表2可以看出：多態(tài)信息含量為0.35，處于中度多態(tài)。經(jīng)χ2適合性檢驗，T5357C位點在該群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 突變位點等位基因的群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.4 基因型與經(jīng)濟性狀的相關性分析 對突變位點的3種基因型4個經(jīng)濟性狀進行相關性分析，結(jié)果見表3。從表3可見，AA基因型大理石紋評分顯著高于BB型，A等位基因為大理石紋性狀有利等位基因。BB基因型活重顯著高于AA型，B等位基因為活重性狀有利等位基因。

表3 CTSB T5357C位點多態(tài)性對牛生產(chǎn)性狀的影響

3 討論

CTSB基因在畜牧業(yè)中作為影響肉質(zhì)和胴體性狀的候選基因已有研究。Edyta等發(fā)現(xiàn)，CTSB基因外顯子7上的一個HpyCH4ⅢRFLP位點呈現(xiàn)多態(tài)，其中CC基因型相對于TT基因型對剪切力和脂肪含量的貢獻較小（P＜0.05）［8］。陳磊等［9］采用 PCR-RFLP 方法，分析了豬CSTB基因多態(tài)性與嫩度性狀的關系。Ribeca等研究了CTSD、CTSB等15個基因的遺傳變異與皮爾蒙特牛肉質(zhì)性狀的關系［10］。牛CTSB基因定位于牛8號染色體，含有 9 個外顯子，全長 8 485 bp（GeneID：281108），但國內(nèi)未見與牛肉質(zhì)和胴體性狀的相關性分析。本研究中，首次發(fā)現(xiàn)CTSB基因內(nèi)含子6的AciⅠ-RFLP的T5357C突變對大理石紋性狀和活重有顯著影響，AA型（2.46±1.04）的大理石紋評分顯著高于BB型（1.87±0.80），AA型的活重（349.68kg±50.90kg）卻明顯低于BB型（378.78 kg±49.06 kg）。因此，T5357C位點作為新的既影響牛生長又影響肉質(zhì)經(jīng)濟性狀的分子標記值得探討，該位點應用于標記輔助選擇提供了一定的參考，也為該牛群體的進化研究提供了一些參考。此外活重性狀也可能受月齡的影響，所以該位點的應用期望在更多品種中進行更深入驗證，為生產(chǎn)實踐提供可靠的理論依據(jù)。

［1］盧士英，任洪林，柳增善，等.組織蛋白酶B研究進展［J］.河北師范大學學報，2004，28（3）：306-309.

［2］陳琳.溶酶體組織蛋白酶及其在肌肉成熟中的作用［J］.江西農(nóng)業(yè)學報，2008，20（2）：72-75.

［3］Qian F，F(xiàn)rankfater A，Chan S J，et al.The structure of the mouse cathepsin B gene and its putative promoter［J］.DNA and Cell Biology，1991，10（3）：159-168.

［4］Dong S S，Stransky G I，Whitaker C H，et al.Avian cathepsin B cDNA：sequence and demonstration that mRNA of two sizes are produced in cell types producing large quantities of the enzyme［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1995，1251：69-73.

［5］Russo V，F(xiàn)ontanesi L，Davoli R，et al.Investigation of candidate genes for meat quality in dry-cured ham production：the porcine cathepsin B（CTSB） and cycstatin B（CSTB） genes［J］.Anim Genet，2002，33（2）：123-131.

［6］Huang F L，Tappel A L.Action of cathepsins C and D inprotein hydrolysis［J］.Biochem Biophys Acta，1971（236）：739-748.

［7］Russo V，F(xiàn)ontanesi L，Scotti E，et al.Single nucleotide polymorphisms in several porcine cathepsin genes are associated with growth，carcass and production traits in Italian large white pigs［J］.Journal of Animal Science，2008，86：3300-3314.

［8］Edyta J K，Stanislaw J，Rosochacki，et al.Polymorphism in CTSB exon 7 as associated with activity of the lysosomal proteases in longissimus dorsi muscle of growing Friesian bulls［J］.Animal Science Papers and Reports，2007，25（4）：201-209.

［9］陳磊.豬 Cystatin B基因CDNA克隆及遺傳多態(tài)性分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（7）：2120-2127.

［10］Ribeca C，Bittante G，Albera A，et al.Investigation on variability of candidate genes for meat quality traits in Piemontese cattles［J］.Italian Journal of Animal Science，2010，8：2.

SNP of CTSB Gene Intron 6 and Its Associations with the Economic Traits in Cattle

Deng Gui-xin，Xu Shang-zhong，Gao Xue，et al
（Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100094，China）

174 hybrids（Simmental×Luxi cattles）were used to examine the SNP（single nucleotide polymorphism）of the intron 6 of CTSB gene by PCR-RFLP.A T/C mutation was identified at position of T5357C in CTSB gene（NC_007306）.The effects of the mutation on the meat quality and carcass traits were analyzed.The results showed that T5357C polymorphism significantly associated with the marbling trait and live weight（P＜0.05）.Genotype of AA had better marbling grade than BB genotype;Genotype BB had a better live weight than AA.Thus T5357C might be a good marker for two economic traits.

cattle；CTSB gene；meat quality traits；carcass traits

2011-01-26

國家自然科學

“肉牛主要數(shù)量性狀基因SNP標記及MA-EPD估計方法研究”，“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAD28B04）

鄧桂馨（1977-），女，講師，博士研究生。

許尚忠，研究員，博士生導師。

1007-9726（2011）03-0012-03

S823.2

經(jīng)驗交流