王朝莉，李 麗，陳 果，楊尚君，敬保遷，任碧軒，馮 莉

（川北醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究所，四川南充 637000）

川北地區(qū)胃癌特異性表達(dá)基因的克隆

王朝莉，李 麗，陳 果，楊尚君，敬保遷*，任碧軒，馮 莉

（川北醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究所，四川南充 637000）

目的：構(gòu)建胃低分化腺癌組織cDNA消減文庫(kù)，篩選胃癌特異表達(dá)基因。方法：取胃低分化腺癌組織和癌旁正常黏膜組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行SSH構(gòu)建消減文庫(kù)獲得序列標(biāo)簽，與載體連接、克隆、篩選、測(cè)序及同源性檢索。結(jié)果：以癌旁正常黏膜組織為driver、胃低分化腺癌組織為tester成功構(gòu)建cDNA消減文庫(kù)，測(cè)序結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因和人類EST比較，獲得5個(gè)特異性序列標(biāo)簽（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。結(jié)論：應(yīng)用SSH法成功構(gòu)建胃低分化腺癌組織cDNA消減文庫(kù)，初步篩選胃癌部分表達(dá)基因，為尋找川北地區(qū)胃癌發(fā)生發(fā)展的特異性基因奠定基礎(chǔ)。

胃癌；SSH；特異基因

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康和生命的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年有20余萬(wàn)例新發(fā)胃癌患者，占全部惡性腫瘤患者的17.2%，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤發(fā)病率之首。每年胃癌患者死亡人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的23.93%。由于胃癌起病隱匿，發(fā)生的確切機(jī)制至今尚不清楚，臨床早期70%以上毫無(wú)癥狀，中晚期才引起相應(yīng)的臨床癥狀，且易轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，預(yù)后極差。目前最為緊迫的是尋找對(duì)胃癌檢測(cè)靈敏度高、特異性好的檢測(cè)方法，使其能對(duì)胃癌高危險(xiǎn)患者進(jìn)行篩查、對(duì)早期胃癌能特異診斷、對(duì)病情發(fā)展和療效可追蹤考核，從而提前對(duì)高危患者給予干預(yù)治療。本實(shí)驗(yàn)采用SSH技術(shù)，以胃低分化腺癌組織為tester，癌旁正常黏膜組織為driver，期望克隆出可能載有高度特異性目的片段，探索川東北地區(qū)胃癌不同發(fā)展階段的基因表達(dá)變化，為進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)展胃癌的基因診斷和基因治療提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

胃癌組織和癌旁正常黏膜組織來(lái)源于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的胃癌患者，胃癌組織標(biāo)本術(shù)后經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科鑒定為低分化腺癌。

1.2 主要化學(xué)試劑

RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取總RNA；PCR Select cDNA Subtraction試劑盒，50×PCR EnzymeMix，AdvantagePCRCloning試劑盒為美國(guó) Clontech公司產(chǎn)品；NucleoSpin ExtractⅡ（Clontech）和PCR Purification（Qiagen）純化相應(yīng)產(chǎn)物；抑制性PCR產(chǎn)物以T／A方式接入pGEM-T（Promega）載體；文庫(kù)擴(kuò)增使用感受態(tài)大腸桿菌JM109；氨芐青霉素（50 mg／L）及顯色劑X-Gal／IPTG（Gibco）篩選克隆。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的制備 取上述胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜組織，1%PBS（含0.1%DEPC）緩沖液洗滌3次，用RNeasy Mini Kit（Qiagen）試劑盒，按使用說(shuō)明提取癌組織和癌旁組織總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量。

1.3.2 cDNA合成 使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech），參照使用說(shuō)明，取胃癌組織和癌旁組織總RNA各2 μl（2 μg），以RT-PCR方法擴(kuò)增合成雙鏈cDNA，產(chǎn)物經(jīng)NucleoSpin ExtractⅡ（Clontech）純化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物質(zhì)量。

1.3.3 消減雜交及抑制性PCR以PCR Select cDNA Subtraction試劑盒（Clontech）進(jìn)行。以限制性內(nèi)切酶RsaI消化等量胃癌組織和癌旁組織cDNA，純化并回收其產(chǎn)物。以酶切后的癌組織cDNA為tester，癌旁組織為driver，一份tester cDNA與Adaptor 1連接，一份tester cDNA與Adaptor 2R連接，分別將帶有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA片段與等量的driver cDNA混合進(jìn)行第一次消減雜交，然后將兩者雜交后產(chǎn)物和另一份driver cDNA混合進(jìn)行第二次消減雜交。

以稀釋后的第二次消減雜交產(chǎn)物為模板，以試劑盒中的引物1進(jìn)行第一輪抑制性PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：75℃5 min后，94℃30sec，以94℃30sec、66℃30sec、72℃1.5 min，27個(gè)循環(huán)，最后72℃6 min。再將稀釋后的第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，以試劑盒中的巢式PCR引物1和引物2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：94℃30sec、68℃30sec、72℃1.5 min，20個(gè)循環(huán)。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量，并以PCR Purification（Qiagen）純化PCR產(chǎn)物。

1.3.4 cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建、克隆與測(cè)序 將上述PCR產(chǎn)物與pGEM-Tasy（Promega）載體連接，轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2處理的大腸桿菌JM109，鋪于（含X-Gal，IPTG，Amp）LB平板，藍(lán)白斑篩選和快速瓊脂糖凝膠電泳方式篩選陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑選29個(gè)克隆送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，以所測(cè)定的DNA序列為基準(zhǔn)序列，通過(guò)GenBank檢索和同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織鑒定

本實(shí)驗(yàn)所用胃癌組織標(biāo)本和癌旁正常黏膜組織標(biāo)本均經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科鑒定證實(shí)。

2.2 總RNA和cDNA的合成

用Qiagen公司產(chǎn)總RNA快速制備試劑盒提取胃低分化腺癌組織和胃正常黏膜組織的總RNA （圖1），用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit（Clontech）合成cDNA。結(jié)果顯示，無(wú)論是在胃低分化腺癌組織中還是胃正常黏膜組織中都存在相應(yīng)基因的大量表達(dá)，為構(gòu)建消減文庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

2.3 胃癌特異表達(dá)基因片段的制備

以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA為tester，正常組織cDNA為driver進(jìn)行SSH和抑制性PCR，產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，在200～800bp范圍內(nèi)的存在一系列基因片段（圖2）。

2.4 胃癌cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序及序列分析

經(jīng)過(guò)pGEM-T載體連接的序列片段由JM109菌克隆，存在大量的陽(yáng)性重組子，選取有明顯條帶的克隆進(jìn)行序列測(cè)定，獲得5個(gè)特異性序列標(biāo)簽（NBPF1、FAM48A、RXFP2、 QDPR和ACTB）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用SSH對(duì)胃低分化腺癌組織和胃正常黏膜組織提取的RNA進(jìn)行逆向PCR合成cDNA，產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ酶切后連上接頭，進(jìn)行消減雜交，測(cè)序結(jié)果獲得5個(gè)特異性序列標(biāo)簽（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。NBPF1基因（neuroblastoma breakpoint family，member 1）：NBPF基因是一種在基因復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)相互易位產(chǎn)生的融合基因家族，Sherif ZA等[1]報(bào)道其與乳腺癌有關(guān)，Sossey-Alaoui K等[2]報(bào)道其與腎上腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤 （Ganglioneuroblastoma）有關(guān)，Roberts T等[3]報(bào)道與惡性成神經(jīng)細(xì)胞瘤有關(guān)；RXFP2基因（relaxin/insulin-like family peptide receptor 2）是松弛素家族肽受體的成員，富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體，在細(xì)胞的代謝過(guò)程中能引起cAMP的升高[4]，Halls ML等[5]報(bào)道其隱睪病和不育癥有關(guān)；QDPR基因（quinoid dihydropteridine reductase）：醌型二氫喋呤還原酶基因，位于4p15.3，在BH4的循環(huán)中起關(guān)鍵作用，F(xiàn)arrugia R等[6]報(bào)道其突變會(huì)導(dǎo)致BH4的循環(huán)障礙，導(dǎo)致高苯丙氨酸血癥和苯丙酮癥的產(chǎn)生，Schochet TL等[7]報(bào)道其與青少年的吸煙有一定的關(guān)聯(lián)，Lee PL[8]報(bào)道其與哺乳動(dòng)物飲食中的三價(jià)鐵離子的還原有一定的關(guān)系；FAM48A基因：亦稱C13orf19，Kunze D等[9]和Schmidt U等[10]報(bào)道其與前列腺癌有關(guān)。以上這四種基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展未見(jiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。ACTB基因（actin beta）：細(xì)胞骨架蛋白基因，Humar B等[11]報(bào)道其與彌散型胃癌有一定的關(guān)系。我們將深入研究這些基因的功能及其與胃癌的作用機(jī)制。

本研究采用SSH技術(shù)從整體層次對(duì)川北地區(qū)臨床胃低分化腺癌組織和胃黏膜正常組織差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，所篩選到的基因應(yīng)是與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，觀測(cè)這些基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的變化，可以從分子水平揭示川北地區(qū)胃癌的發(fā)病機(jī)制，比較這些基因在胃癌和其他腫瘤中的表達(dá)變化，可以篩選到具有川北地區(qū)特異性表達(dá)的胃癌基因，可以發(fā)展川北地區(qū)對(duì)胃癌具有篩查和早期實(shí)驗(yàn)室診斷的方法以及具有特異性治療和預(yù)防的手段。

[1]Sherif ZA,Danielsen M.Balanced t(11;15)(q23;q15)in a TP53+/+ breast cancer patient from a Li-Fraumeni syndrome family[J].Cancer Genet Cyt-ogenet,2006,168(1):50-58.

[2]Sossey-Alaoui K,Su G,Malaj E,et al.WAVE3,an actin-polymerization gene,is truncated and inactivated as a result of a constitutional t(1;13) (q21;q12)chromosome translocation in a patient with ganglioneuroblastoma [J].Oncogene,2002,21(38):5967-5974.

[3]Roberts T,Chernova O,Cowell JK.NB4S,a member of the TBC1 domain family of genes,is truncated as a result of a constitutional t(1; 10)(p22;q21)chromosome translocation in a patient with stage 4S neuroblastoma[J].Hum Mol Genet,1998,7(7):1169-1178.

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Cloning associated special genes in gastric cancer of North Sichuan Area

WANG Chaoli,LI Li,CHEN Guo,YANG Shangjun,JING Baoqian*,REN Bixuan,FENG Li
（Molecular biology research institute of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China)

Objective:To construct cDNA subtracted libraries from gastric poorly differentiated adenocarcinoma and screen differentially expressed genes.Methods:Relatively pure gastric poorly differentiated adenocarcinoma and normal gastric mucous membrance were procured,and abstracted the total RNA,and the cDNA was been reversed transcription, which was used to carry on for suppression subtractive hybridization(SSH).Subtracted cDNA fragments were linked with vector,cloned,screened,sequenced,and made homologous search.Results:The subtracted cDNA libraries were constructed with the tester of gastric poorly differentiated adenocarcinoma and the driver of normal mucosa tissue beside of the dysplasia.The sequenced result compared with the known genes of PubMed and human EST and five specificity sequences were procured(NBPF1,FAM48A,RXFP2,ACTB and QDPR).Conclusion:Subtracted cDNA libraries from gastric poorly differentiated adenocarcinoma using SSH.Some fragments have been screened and verified to help to search for novel associated genes with gastric cancer of North Sichuan Area.

Gastric cancer;Suppression subtractive hybridization;Special gene

R735.2

A

1673-7210（2011）02（b）-019-03

*通訊作者

2010-12-10）