譚秀芳,李曉瑾,王 強(qiáng),石明輝,楊 杰,曹 園

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆烏魯木齊 830054;2.新疆中藥民族藥研究所,新疆烏魯木齊 830002;3.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院,江蘇南京 210009)

地錦草為大戟科植物地錦 Euphorbia hum ifusa W illd.或斑地錦 Euphorbia m aculataL.的干燥全草,是中醫(yī)、蒙醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材,在《中華人民共和國(guó)藥典》、《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥品分冊(cè)》和《內(nèi)蒙古藥材標(biāo)準(zhǔn)》均有記載[1,2]。中醫(yī)認(rèn)為:地錦草具有清熱解毒、涼血止血之功能,多用其治療菌痢、腸炎、病毒性肝炎、各種出血癥等疾病;地錦草維吾爾醫(yī)習(xí)用名為夏塔熱 (Xiahatereqini)、雅麗蔓 (Yalman-kulake),維醫(yī)認(rèn)為:地錦草具有清除異常黏液質(zhì)、膽液汁及敗血、消腫止癢之功能,多用其復(fù)方治療手癬、體癬、足癬、銀屑病、過(guò)敏性皮炎等疾病,維醫(yī)臨床應(yīng)用地錦草與中醫(yī)有很大差異,具有特色之處。地錦草分布于全國(guó)各地,資源極其豐富。而目前,有報(bào)道其化學(xué)成分主要有黃酮、三萜、香豆素、甾醇、鞣質(zhì)及酚酸類(lèi)等化合物[3],對(duì)地錦草的研究還很缺乏,質(zhì)量評(píng)價(jià)方面僅建立了地錦草中蘆丁、槲皮素、木犀草素和山柰酚 4種有效成分的含量測(cè)定方法,對(duì)其指紋圖譜研究未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文通過(guò)對(duì)新疆和田 10個(gè)地區(qū)的地錦草 HLPC指紋研究和分析,建立了地錦草的 HPLC指紋圖譜,為控制維吾爾藥材地錦草質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

Agilent1100高效液相色譜儀,H66MC型超聲清洗振蕩器,Sartorius BS110S萬(wàn)分之一分析天平。甲醇為色譜純 (漢邦),水為市售純凈水。地錦草藥材(10批)主要來(lái)自新疆和田墨玉縣 (見(jiàn)表1)。經(jīng)新疆中藥民族藥研究所李曉瑾研究員鑒定為地錦草。

表1 樣品采集地及采集時(shí)間

2 方法與結(jié)果

2.1 以蘆丁峰為參照峰建立指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Shim-pack ODS C18(150 mm ×4.6 mm.i.d.,5.0μm);流動(dòng)相:

A液:0.1%磷酸,B液:甲醇,按表2梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為 272 nm,柱溫為 30℃,進(jìn)樣量:5μL。檢測(cè)時(shí)間為 60min。

表2 梯度洗脫程序

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品適量,加甲醇制成溶液,即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 將地錦草藥材粉碎(過(guò) 40目篩 ),取 500 mg精密稱(chēng)定,加入 20 mL甲醇,超聲處理 30 min,過(guò)濾,用少量甲醇洗滌殘?jiān)?合并至濾液中,回收至干,加適量水混懸,用正丁醇萃取三次,每次 20 mL,合并萃取液,減壓回收至干,殘?jiān)眉状嫁D(zhuǎn)移并定容至 10 mL,精密吸取 1 mL,定容至 10 mL,過(guò) 0.45μm的微孔濾膜,即得。

2.1.4 測(cè)定方法 各供試品溶液進(jìn)樣 5μL,在上述色譜條件下進(jìn)行分離測(cè)定,記錄色譜圖。以蘆丁特征峰為參照峰,計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 精密度試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地供試品 (S1)溶液 5μL,連續(xù)進(jìn)樣 5次,測(cè)定指紋圖譜,結(jié)果表明,共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于 0.4%,表明儀器精密度良好。

2.1.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品 (S1)溶液 5μL,分別在 0、2、4、8、24、48 h進(jìn)樣 5次,結(jié)果表明,共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 1.2%,表明供試品溶液在 48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地樣品 (S1)粉末 5份,制備供試品溶液,測(cè)定指紋圖譜,結(jié)果表明共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.7%,表明本法測(cè)定的重現(xiàn)性良好。

2.1.6 HPLC指紋圖譜的建立

取供試品溶液 5μL,注入液相色譜儀,按選定的測(cè)試條件進(jìn)行檢測(cè)。同一條件下,測(cè)定所有供試品的 HPLC色譜圖 (見(jiàn)圖1)。根據(jù) 10批次供試品測(cè)定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值 (積分值)和峰位 (相對(duì)保留時(shí)間)等相關(guān)參數(shù),進(jìn)行分析、比較,制定優(yōu)化的指紋圖譜。

圖1 10批藥材標(biāo)準(zhǔn) HPLC圖譜

2.1.7 指紋圖譜分析

按 2.1.4項(xiàng)測(cè)定 10批地錦草樣品和對(duì)照品,其色譜圖見(jiàn)圖1,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3、4。根據(jù) 10批供試樣品 HPLC圖給出的相關(guān)參數(shù),比較、分析供試品譜圖和對(duì)照品譜圖,采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰,標(biāo)定了 13個(gè)峰為共有指紋峰,建立了地錦草藥材的 HPLC圖譜。共有指紋峰的峰號(hào) (相對(duì)保留時(shí)間):1(0.210),2(0.329),3(0.434),4(0.446),5(0.534),6(0.622),7(0.637),8(0.652),9(0.707),10(S)(1),11(1.062),12(1.104),13(1.133)。

表3 地錦草藥材共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 地錦草藥材共有峰峰面積比值

地錦草相似度評(píng)價(jià):將 10個(gè)批次地錦草樣品HPLC測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) (2004A)”軟件,經(jīng)校正,將譜峰自動(dòng)匹配,然后生成對(duì)照?qǐng)D譜,進(jìn)行譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)。通過(guò)中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件得出地錦草樣品 HPLC指紋圖譜共有模式圖,見(jiàn)圖2,與共有模式比較,10個(gè)批次地錦草相似度見(jiàn)表5。

圖2 10批地錦草 HPLC指紋圖譜共有模式圖

圖3 地錦草藥材的全波長(zhǎng)掃描圖

表5 10批地錦草藥材相似度

3 討 論

3.1 提取方法的考察

考察不同濃度甲醇 (0%,30%,60%,90%,100%)及乙醇 (0%,30%,60%,90%,100%)的提取效率,以 100%甲醇的提取液中色譜峰的數(shù)目及總峰面積最大,因此選擇甲醇為提取溶劑?？疾旒状祭浣⒊?30 min及加熱回流 1 h的總峰面積,以甲醇超聲 30 min及加熱回流 1 h總峰面積最大,由于超聲法省時(shí),所以選擇甲醇超聲 30 min。

以甲醇提取液直接進(jìn)樣發(fā)現(xiàn),基線漂移嚴(yán)重,雜質(zhì)峰多,干擾嚴(yán)重。將提取液回收至干,水混懸,正丁醇萃取后,雜質(zhì)去除干凈,大多數(shù)色譜峰達(dá)到基線分離。因此,將樣品用甲醇提取后,用正丁醇萃取,去除雜質(zhì),富集所需成分。為保證萃取完全,進(jìn)一步對(duì)萃取次數(shù)進(jìn)行考察,分別用等量正丁醇萃取 1次,2次,3次,4次,5次,發(fā)現(xiàn)萃取至 3次時(shí)總峰面積不再增加,證明用等量正丁醇萃取 3次能保證成分充分提取。

3.2 流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇 -水、乙腈 -水、甲醇 -乙腈 -水系統(tǒng),以甲醇 -水系統(tǒng)色譜峰分離度最佳,因此,選擇甲醇 -水系統(tǒng)為流動(dòng)相。另外,此時(shí)色譜峰拖尾嚴(yán)重?？疾炝思状?-0.5%甲酸水、甲醇 -0.5%乙酸水、甲醇 -0.1%磷酸水系統(tǒng),以甲醇 -0.1%磷酸水系統(tǒng)所得色譜峰峰形最佳,因此,最終采用甲醇-0.1%磷酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng) DAD檢測(cè)器在 190～400 nm掃描,在 272 nm左右給出的色譜峰信息較多,且各個(gè)色譜峰響應(yīng)值相當(dāng),所以選擇 272 nm處檢測(cè) (見(jiàn)圖3)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知研究采用了 HPLC技術(shù),建立了地錦草的指紋譜。在實(shí)驗(yàn)色譜條件下,能得到較多的色譜峰且分離效果好,椐此所得的相對(duì)保留值也十分穩(wěn)定,所建立的色譜指紋譜具有較大的穩(wěn)定性和可控性。我們認(rèn)為該方法能得到地錦草藥材所含組分的大量信息,其指紋譜能反映地錦草藥材的內(nèi)在品質(zhì)。可用于地錦草藥材品質(zhì)和真?zhèn)纹返蔫b別。

[1] 額爾登高娃,賀喜格達(dá)來(lái).地錦草蒙醫(yī)應(yīng)用與研究[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志,2008,1(1):29.

[2] 李治建,古力娜·達(dá)吾提,斯拉甫·艾白.維藥地錦草的研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志,2008,8(8):15

[3] 柳潤(rùn)輝,孔令義.地錦草脂溶性成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2005,17(4):437.