劉一丹,陳 鈞＊,丁曉瑜,楊學(xué)娟,郭丹釗,2

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.河南科技學(xué)院生科院,河南新鄉(xiāng) 453003)

喙果絞股藍(lán)(Gynostemm a yixingenseC.Y.Wu et S.K.Chen.)是葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草本植物,生于海拔 60～100 m的林下灌叢中,主要分布于江蘇宜興、浙江杭州等地,是中國(guó)東南部地區(qū)特色資源,與同屬植物絞股藍(lán)〔G.pentaphyllum(Thunb.)Makino.〕成分相似,主要含絞股藍(lán)黃酮類及皂甙類成分[1-4]。喙果絞股藍(lán)與絞股藍(lán)屬其他 9種植物已成為開(kāi)發(fā)絞股藍(lán)屬植物的研究熱點(diǎn)[5-10]。

目前,喙果絞股藍(lán)的研究主要集中在采用比色法對(duì)總黃酮以及總皂甙的定量測(cè)定上[8-9],而未見(jiàn)采用 HPLC測(cè)定喙果絞股藍(lán)中皂甙類與黃酮類成分的分析方法的研究。本研究以蘆丁、槲皮素為指標(biāo)性成分,首次建立反相高效液相同時(shí)測(cè)定喙果絞股藍(lán)中蘆丁、槲皮素含量的方法,并測(cè)定了不同生長(zhǎng)月份的含量動(dòng)態(tài)變化,以期為該資源的基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與試藥

島津 LC-20AT高效液相色譜儀 (N2000色譜工作站、LC-20A檢測(cè)器),Shimadzu UV 2550紫外分光光度計(jì),AT-201電子分析天平 (d=0.01 mg,瑞士),蘆丁對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào) 0753- 9910)、槲皮素對(duì)照品 (德國(guó),Lot85H0694);甲醇 (色譜純,國(guó)藥)、磷酸等其它試劑均為分析純,水為娃哈哈純凈水。五批喙果絞股藍(lán)地上部分 (7、8、9、10、11月份 )采自江蘇省鎮(zhèn)江市南山植物園,經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院陳鈞教授鑒定為喙果絞股藍(lán) (G.yixingenseC.Y.Wu et S.K.Chen.)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特 SinoChromODS-APC18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流動(dòng)相:采用甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫 (0～20 min,40%∶60%,20～60 min,50% ∶50%,60～75 min,60% ∶40%,75～90 min,70% ∶30%,v/v);檢測(cè)波長(zhǎng):364 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30℃。對(duì)照品和喙果絞股藍(lán)供試品色譜圖,見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品和喙果絞股藍(lán)供試品 HPLC圖譜

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定干燥至恒重的蘆丁、槲皮素對(duì)照品各9.5300 mg、3.6800 mg,至 25 mL容量瓶 ,加甲醇溶解定容,制成含蘆丁 0.3812 mg/mL、槲皮素 0.1472 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取,11月喙果絞股藍(lán)粉末 (過(guò) 24目篩)2.0 g,置索氏提取中,加石油醚 50 mL,加熱回流至提取液無(wú)色,放冷,棄去石油醚液,藥渣連同濾紙筒揮干溶劑后,移入燒瓶中,精密加入甲醇 25 mL,稱定重量,回流提取 3 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足失重,精密量取 4 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至 1 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用 0.45μm濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,按上述色譜條件,進(jìn)樣 20μL,即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

按“2.2項(xiàng)”下操作,精密吸取對(duì)照品溶液稀釋1、10 、20、30、40、50倍 ,按上述色譜條件 ,進(jìn)樣20μL,測(cè)定峰面積值,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) (X),峰面積為縱坐標(biāo) (Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蘆丁的回歸方程為:Y=106X-15196,r=0.999 8,槲皮素的回歸方程為:Y=3×106X-55589,r=0.999 9;蘆丁的線性范圍:0.152 5～3.812 0μg,槲皮素的線性范圍:0.058 9～1.472 0μg,呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣20μL,連續(xù)進(jìn)樣 5次,以峰面積計(jì)算,蘆丁、槲皮素日內(nèi) RSD分別為:0.7%、1.6%;精密吸取對(duì)照品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣 20μL,連續(xù) 3天,每天進(jìn)樣 1次,以峰面積計(jì)算,蘆丁、槲皮素日間 RSD分別為 1.6%、1.5%,儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“2.3項(xiàng)”下操作制備的供試品溶液,分別于3、6、9、12、24 h,按上述色譜條件 ,進(jìn)樣 20μL,以峰面積計(jì)算,蘆丁、槲皮素的 RSD分別為 0.7%、1.4%,說(shuō)明供試品溶液在 24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取取同一樣品 6份,每份 2 g,照“2.3項(xiàng)”下操作制備供試品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣20μL,以峰面積計(jì)算,測(cè)得蘆丁、槲皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.2425 mg/g和 0.0336 mg/g,RSD分別為1.8%、1.7%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取,已知含量 11月份喙果絞股藍(lán)樣品(過(guò) 24目篩)1 g共 6份,加入蘆丁對(duì)照品溶液(0.12 mg/mL)1 mL,槲皮素對(duì)照品溶液 (0.027 mg/mL)1 mL,照“2.3項(xiàng)”下的方法制備供試品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣 20μL,以峰面積計(jì)算,測(cè)定蘆丁、槲皮素的加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁、槲皮素的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測(cè)定

精密稱取 7、8、9、10、11月份 ,共 5個(gè)月份 ,喙果絞股藍(lán)粉末 (過(guò) 24目篩)各 2 g,按“2.3”項(xiàng)下操作制備供試品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣 20μL,以峰面積計(jì)算,測(cè)定喙果絞股藍(lán)在 7～11月內(nèi)蘆丁、槲皮素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同月份喙果絞股藍(lán)中蘆丁、槲皮素的含量測(cè)定(n=3)

3 討 論

(1)檢測(cè)波長(zhǎng)選擇。對(duì)蘆丁對(duì)照品和槲皮素對(duì)照品溶液紫外光譜的測(cè)定,Shimadzu UV 2550紫外分光光度計(jì)上在 190～500 nm進(jìn)行掃描,根據(jù)所得的紫外吸收光譜蘆丁在 357 nm處有最大吸收,槲皮素在 375 nm處有最大吸收,適量混合蘆丁和槲皮素對(duì)照品溶液,在 364 nm處有最大吸收,綜合選擇測(cè)定波長(zhǎng)為 364 nm。

(2)流動(dòng)相選擇。分別用甲醇 -水、甲醇 -磷酸溶液系統(tǒng),對(duì)供試品進(jìn)行等度洗脫,難以較好分離;分別配制 0.2%、0.4%、0.6%的磷酸溶液,與甲醇配比進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明,甲醇 -0.4%磷酸溶液 =(40∶60)洗脫時(shí),目標(biāo)峰與相鄰的色譜峰分離度與色譜峰峰形均好,所以流動(dòng)相采用甲醇-0.4%磷酸溶液系統(tǒng),梯度洗脫 (0～20 min,40%∶60%,20～60 min,50% ∶50%,60～75 min,60% ∶40%,75～90 min,70% ∶30%,v/v),各峰分離度及對(duì)稱性均較好,能為喙果絞股藍(lán)定性鑒別作參考,亦可以作為指紋圖譜用于喙果絞股藍(lán)的質(zhì)量控制。

(3)本實(shí)驗(yàn)首次建立 RP-HPLC同時(shí)測(cè)定喙果絞股藍(lán)中蘆丁、槲皮素的含量測(cè)定方法,該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好,為喙果絞股藍(lán)質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,喙果絞股藍(lán)中蘆丁和槲皮素的含量各具季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,呈先升高后下降的趨勢(shì)。蘆丁在 8月份時(shí)含量最高,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 6.31 mg/g,槲皮素在 9月份時(shí)含量較高,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 0.86 mg/g,各月份含量差異較大。這種含量動(dòng)態(tài)變化可能與喙果絞股藍(lán)的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、生長(zhǎng)環(huán)境及物種的遺傳性有關(guān)。因此,喙果絞股藍(lán)資源的開(kāi)發(fā)利用要充分重視季節(jié)性等外部因素,及自身發(fā)育規(guī)律,為該資源的合理開(kāi)發(fā)和綜合評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)條件。

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