闕冬梅,張軍民,胡永軒,魯 莎,王 麗,覃 巍

TLR9參與巨噬細胞吞噬馬爾尼菲青霉的作用研究＊

闕冬梅1,張軍民1,胡永軒1,魯 莎1,王 麗1,覃 巍2

目的 探討 TLR9在巨噬細胞吞噬馬爾尼菲青霉中所起的作用。方法半定量RT-PCR檢測馬爾尼菲青霉及其基因組DNA對RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄的影響;CFU檢測 TLR9對RAW 264.7細胞吞噬馬爾尼菲青霉能力的影響。結(jié)果馬爾尼菲青霉菌絲相和酵母相、基因組DNA及人工合成Cp G-ODN均可使RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),且其上調(diào)作用均可被氯喹阻斷。TLR9可增強RAW 264.7細胞對馬爾尼菲青霉分生孢子的吞噬能力但不能增強其對酵母細胞的吞噬能力。結(jié)論表明巨噬細胞 TLR9參與對馬爾尼菲青霉分生孢子的吞噬過程。

馬爾尼菲青霉;DNA;RAW 264.7細胞;TLR9;氯喹

馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei,P.marneffei)是青霉屬唯一的雙相性致病真菌。改變溫度可調(diào)節(jié)其雙相性轉(zhuǎn)變,即室溫25℃條件下表現(xiàn)為菌絲相而37℃體內(nèi)環(huán)境下表現(xiàn)為酵母相,酵母相是其致病相。P.m arneffei感染人體引起馬爾尼菲青霉病(penicilliosis marneffei,PSM),主要累及網(wǎng)狀內(nèi)皮-巨噬細胞系統(tǒng)[1],不及時進行系統(tǒng)抗真菌治療者常引起全身廣泛播散,病死率高。

Tokunaga等最先從BCG提取物發(fā)現(xiàn)DNA具有免疫刺激性[2],其免疫刺激性依賴未甲基化的Cp G結(jié)構(gòu)即Cp G-DNA。人工合成的非甲基化的Cp G結(jié)構(gòu)即Cp G-ODN同樣具有免疫刺激活性[3],且Cp G-DNA是通過 TLR9激活免疫細胞[4]。最后證實包括細菌、病毒及真菌來源的DNA均是TLR9的天然配體。TLR9廣泛表達于各種免疫細胞,包括BD-DC、巨噬細胞、B淋巴細胞等,是一種 I型跨膜蛋白[5]。

通過呼吸道吸入環(huán)境中的分生孢子被認為是P.m arneffei進入人體的最常見途徑[6],因此肺泡巨噬細胞很有可能是宿主抵抗 P.m arneffei感染的第一道防線。本研究通過巨噬細胞與 P.m arneffei及其基因組DNA共培養(yǎng)后測定巨噬細胞TLR9基因轉(zhuǎn)錄水平,CFU檢測TLR9對巨噬細胞吞噬 P.m arneffei能力的影響,探討巨噬細胞TLR9在吞噬 P.m arneffei中的作用。

1 材料與方法

1.1 巨噬細胞培養(yǎng) 小鼠單核-巨噬細胞系RAW 264.7細胞購自武漢大學(xué)中國典藏物保存中心(CCTCC)。無菌操作復(fù)蘇用含 10%FBS的DM EM培養(yǎng)液在含5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天,ED TA-胰酶消化傳代2～3次后轉(zhuǎn)至6孔板,調(diào)整細胞密度為1×106/m L,每孔1 mL。根據(jù)實驗要求分組。

1.2 菌株 P.m arnef fei菌株(SUM S 0152)分離自一位2歲PSM患者,經(jīng)形態(tài)學(xué)及DNA測序鑒定為 P.m arnef fei。P.marneffei接種于沙堡弱培養(yǎng)基(SDA),37℃溫箱孵育,每10 d轉(zhuǎn)1次,連續(xù)轉(zhuǎn)2～3次,乳酸酚棉藍染色顯微鏡下觀察酵母相形態(tài),待真菌完全轉(zhuǎn)為單細胞性酵母細胞且無菌絲,收集制備 P.m arneffei酵母細胞懸液,計數(shù)4℃保存?zhèn)溆谩.marneffei接種于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基(PDA),25℃室溫下培養(yǎng)7～9天PBS反復(fù)沖洗培養(yǎng)基表面,離心去色素,PBS重懸,鏡下觀察為單細胞性分生孢子,計數(shù),4℃保存?zhèn)溆?。酵母細胞及分生孢子的滅活均采?5℃熱滅活30 m in。

1.3 主要試劑 Real-time PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa公司。胎牛血清購自天津TBD公司。DM EM培養(yǎng)基為 Gibco公司產(chǎn)品。真菌大量DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司。Cp GODN 1826序列參考文 獻,序 列 為 5′-TCCA TGACGTTCCTGACGTT-3′由上海英韋創(chuàng)津公司合成經(jīng)硫代修飾并PAGE純化。氯喹(chloroquine,CQ)購自sigma公司。TRIzol試劑購自 Invitrogen公司。

1.4 RT-PCR檢測不同刺激條件下RAW 264.7細胞TLR9基因轉(zhuǎn)錄水平 實驗分組:① P.marneffei活分生孢子組;②P.m arneffei滅活分生孢子組;③P.m arneffei活酵母細胞組;④P.marneffei滅活酵母細胞組;RAW 264.7細胞與 P.marneffei酵母細胞及分生孢子共培養(yǎng)均設(shè)6個不同時間點 ,分別為 0 m in、15 m in、30 m in、1 h、2 h、4 h,酵母細胞及分生孢子與巨噬細胞的比例均為4～5∶1;⑤不同濃度 PM-DNA與 RAW 264.7細胞共培養(yǎng)組:0μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/m L、0.5μg/m L、1.0μg/m L;⑥陰性對照、0.5μg/m L PMDNA、0.5μg/m L PM-DNA+CQ、0.5μg/m L Cp G-ODN 1826、0.2μg/mL Cp G-ODN 1826+CQ共培養(yǎng)1 h,CQ濃度為20μmol/L。

總RNA提取及RT-PCR檢測 按 TRIzol試劑說明書提取 RAW 264.7細胞總 RNA,采用Dnase I處理純化RNA。紫外分光光度計測定純度及濃度。各組分別以等量約為0.5～1.0μg的總RNA為模板合成cDNA。采用 TaKaRa公司 PCR試劑盒擴增。RAW 264.7細胞 TLR9引物序列:上游引物 5′-CTACAACAGCCAGCCCTTTA-3′,下游引物 5′-GCTGAGGTTGACCTCTTTCA-3′,產(chǎn)物大小為540 bp。內(nèi)參β-actin引物序列:上游引物5′-A TGGA TGACGA TA TCGCT-3′,下游引物 5′-A TGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′,產(chǎn) 物 大 小 為568 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 m in,按94℃40 s,58℃40 s,72℃1 min,TLR9采用28個循環(huán),β-actin采用25個循環(huán),72℃終延伸10 min。產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察并測定灰度值。以 TLR9/β-actin的灰度比值衡量TLR9基因轉(zhuǎn)錄水平,以上實驗均重復(fù)3次,求平均值。

1.5 CFU檢測 TLR9對RAW 264.7細胞吞噬 P.m arneffei分生孢子及酵母細胞的影響 分組:①酵母細胞空白對照組;②酵母細胞陽性組;③分生孢子空白對照組;④分生孢子陽性組?？瞻讓φ战M直接加分生孢子或酵母細胞,陽性組以 0.5μg/m L PM-DNA預(yù)刺激 RAW 264.7細胞2 h。不同條件下RAW 264.7細胞與 P.marneffei分生孢子共培養(yǎng)1 h,與酵母細胞共培養(yǎng)2 h,去上清,PBS洗去未被吞噬的 P.m arnef fei,每孔以4℃預(yù)冷的無菌雙蒸水 1 m L裂解細胞,倍比稀釋至 1 000倍,取100μL涂SDA平皿培養(yǎng)基,37℃溫箱培養(yǎng)2～3 d,菌落計數(shù)。每孔涂3個復(fù)培養(yǎng)皿,重復(fù)實驗3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料用均數(shù)±標準差表示,使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,兩組間均數(shù)比較采用兩組獨立樣本t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄的趨勢變化 P.marneffei分生孢子及酵母細胞均可使RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄水平升高,其中活分生孢子、活酵母細胞及滅活酵母細胞組RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄峰值均在共培養(yǎng)30 min,以后維持較高水平。滅活分生孢子組高峰出現(xiàn)時間較晚,在共培養(yǎng) 2 h出現(xiàn)(圖 1)。PMDNA刺激RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄具有濃度依賴性,以0.5μg/m L PM-DNA刺激時轉(zhuǎn)錄水平最高。(圖2A、B)人工合成 Cp G-ODN1826亦可上調(diào)RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄。CQ抑制PM-DNA和人工合成 Cp G-ODN 1826對 RAW 264.7細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)作用,見圖3。

2.2 CFU檢測 TLR9對巨噬細胞吞噬 P.m arneffei分生孢子及酵母細胞的影響 應(yīng)用PMDNA預(yù)刺激RAW 264.7細胞上調(diào) TLR9基因轉(zhuǎn)錄可增強RAW 264.7細胞對 P.marneffei分生孢子的吞噬作用,分生孢子空白對照組與分生孢子陽性組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);應(yīng)用 PM-DNA預(yù)刺激RAW 264.7細胞上調(diào) TLR9基因轉(zhuǎn)錄不能增強RAW 264.7細胞對 P.m arnef fei酵母細胞的吞噬作用,酵母細胞空白對照組與酵母細胞陽性組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

3 討 論

P.m arneffei是已知的青霉菌屬中唯一溫度依賴的雙相型條件致病真菌,酵母相是其致病相。關(guān)于 P.marneffei可能的致病基因、蛋白及與宿主的相互作用機制已成為闡明PSM發(fā)病機制研究的核心。呼吸道吸入環(huán)境中的分生孢子被認為是P.m arneffei進入機體的最常見途徑,肺泡巨噬細胞很可能參與對 P.marneffe的免疫反應(yīng)。因此該研究選擇RAW 264.7細胞株作為研究對象,探討巨噬細胞 TLR9是否參與對 P.m arneffei分生孢子及酵母細胞吞噬,并為 TLR9影響下游適應(yīng)性免疫的研究奠定基礎(chǔ)。

實驗發(fā)現(xiàn) P.m arneffei分生孢子及酵母細胞均可使巨噬細胞 TLR9基因轉(zhuǎn)錄水平升高,并且在一定時間點達到高峰,以后維持較高水平,由此推測巨噬細胞 TLR9可能參與了對 P.m arneffei免疫反應(yīng)。P.m arneffei來源的DNA經(jīng)純化后可刺激巨噬細胞 TLR9的基因轉(zhuǎn)錄,并有濃度依賴性。人工合成的Cp G-ODN 1826對其同樣具有刺激活性。表明 P.m arnef fei可能通過其基因組DNA中的Cp G結(jié)構(gòu)活化巨噬細胞 TLR9。

本研究初步探討了氯喹對 P.m arneffei來源的DNA活化巨噬細胞 TLR9途徑的影響。氯喹是一種弱堿性物質(zhì),可提高細胞內(nèi)的p H值,而Cp GDNA活化免疫細胞 TLR9依賴于細胞內(nèi)酸性環(huán)境的形成[7]。研究發(fā)現(xiàn)氯喹通過抑制免疫細胞 TLR9誘導(dǎo)的炎癥因子分泌使膿毒敗血癥實驗動物模型免受急性腎損害[8]。Zhou Hong等證實氯喹可抑制Cp G-ODN對免疫細胞 TLR9基因表達的上調(diào)并減少炎癥因子的分泌[9]。本研究也表明氯喹可抑制P.m arneffei來源的DNA對巨噬細胞 TLR9基因表達的上調(diào),其機制也可能是通過氯喹改變胞內(nèi)的酸性環(huán)境。

實驗結(jié)果表明 P.m arneffei來源的DNA可通過 TLR9增強巨噬細胞對 P.m arneffei分生孢子的吞噬,與 TLR9誘導(dǎo)體內(nèi)外腫瘤細胞的自體吞噬[10],增強巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的吞噬[11],增強小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞對肺炎鏈球菌的吞噬和胞內(nèi)殺傷能力[12]研究結(jié)果相一致。但 TLR9并不能增強巨噬細胞對 P.m arneffei酵母細胞的吞噬能力,因此我們推測巨噬細胞 TLR9可能只參與了對P.m arneffei入侵階段即菌絲相的吞噬而未參與其致病相即酵母相的吞噬作用,因而有可能是 P.marneffei酵母細胞容易逃離巨噬細胞的吞噬而引起播散性感染的原因,但具體機制尚不明確。

已發(fā)現(xiàn) TLR9參與機體抗白念珠菌、新生隱球菌和煙曲霉免疫反應(yīng),表現(xiàn)為促進 Th1型細胞免疫 ,產(chǎn)生 IFN-γ、TNF-α和 IL-12 等炎癥因子 ,減少實驗動物模型臟器載菌量和死亡率[13-15]。我們研究表明 TLR9可增強巨噬細胞對 P.m arnef fei分生孢子的吞噬,而關(guān)于巨噬細胞 TLR9是否及如何影響免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)細胞因子分泌有待于進一步研究闡明。

[1]Segretain G.Penicillium marneffei n.spagent of a mycosis of the reticul endothelial system[J].M y-copathologia,1959,30(11):327-53.

[2]Tokunaga CT,Yamamoto T,Yamamoto S,et al.How BCG led to the discovery of immunostimulatory DNA[J].Jpn J Infect Dis,1999,52(1):1-11.

[3]Krieg AM.CPG motifs in bacterial DNA and their immune effects[J].Annu Rev Immunol,2002,20:709-760.

[4]Hemmi H,Takeuchi O,Kawai T,et al.A Toll-like recep tor recognizes bacterial DNA[J].Nature,2000,408(6813):740-745.

[5]Suzuki K,Suda T,Naito T,et al.Impaired toll-like receptor 9 expression in alveolar macrophages with no sensitivity to Cp G DNA[J].Am J Respir Crit Care Med,2005,171(7):707-13.

[6]Vanittanakom N,Cooper CR Jr,Fisher MC,et al.Penicillium marneffei Infection and recent advances in the epidemiology and molecular biology aspects[J].Clin Microbiol Rev,2006,19(1):95-110.

[7]H?cker H,Mischak H,Miethke T,etal.Cp G-DNA-specific activation of antigen-p resenting cells requires stress kinase activity and is preceded by non-specific endocytosis and endosomalmaturation[J].EMBO J,1998,17(21):6230-6240.

[8]Yasuda H,Leelahavanichkul A,Tsunoda S,et al.Chloroquine and inhibition of Toll-like receptor 9 p rotect from sepsis-induced acute kidney injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294(5):F1050-1058.

[9]Zhou HG,Zheng JB,Wang LX,et al.Chloroquine protects mice from challenge with Cp G ODN and LPS by decreasing proin flammatory cytokine release[J].Int Immunopharmacol,2004,4(2):223-234.

[10]Bertin S,Samson M,Pons C,et al.Comparative Proteomics Study Reveals That Bacterial Cp G Motifs Induce Tumor Cell Autophagy in V itro and in Vivo[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(12):2311-2322.

[11]Wang J,Huang WL,Liu RY,et al.Cp G-ODN enhances ingestion of apoptotic neutrophils by macrophages[J].Clin Exp M ed,2009,9(1):37-43.

[12]Ribes S,Ebert S,Regen T,et al.Toll-like recep to r stimulation enhances phagocytosis and intracellular killing of nonencapsulated and encapsulated strep tococcus pneumoniae by murine microglia[J].Infect Immun,2010,78(2):865-871.

[13]Miyazato A,Nakamura K,Yamamoto N,et al.Toll-Like Recep tor 9-Dependent Activation of Myeloid Dendritic Cells by Deoxynucleic Acids from Candida albicans[J].Infect Immun,2009,77(7):3056-3064.

[14]Nakamura K,Miyazato A,Xiao G,et al.Deoxynucleic Acids from Cryptococcusneo for mans Activate Myeloid Dendritic Cells via a TLR9-Dependent Pathway[J].J Immunol,2008,180(6):4067-4074.

[15]Bozza S,Gaziano R,Lipford GB,et al.Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpGoligodeoxynucleotides as adjuvants[J].Microbes Infect,2002,4(13):1281-1290.

The role of toll-like receptor 9 of macrophage in phagocytizing Penicillium marneffei

QUEDong-mei,ZHANG Jun-min,HU Yong-xuan,LU Sha,WANG Li,Q IN Wei

(Department of Dermatology,Sun Yat-sen Memorial Hospital,Zhong shan University,Guangzhou 510120,China)

To investigate the role of toll-like receptor 9 of macrophage in phagocytizing P.marneffei,semi-quantitative RT-PCR were used to detect the different expressions on m TLR9 of RAW 264.7 cells when stimulated by P.marneffei and its genomic DNA.In addition,CFU was used to evaluate the influence of TLR9 on the ability of phagocytizing P.marneffei by RAW 264.7 cells.The expression of m TLR9 was up-regulated w hen stimulated by conidia,yeast cells and genomic DNA of P.marneffei and synthetic Cp G-ODN.And the expression of m TLR9 was changed accompanied with the concentration of PMDNA.However,the up-regulation of m TLR9 induced by genomic PM-DNA,and synthetic Cp G-ODN could be blocked by chloroquine.On the other hand,TLR9 could enhance the capacity of RAW 264.7 for phagocytizing conidia but not yeast cells.These indicate that TLR9 might participate in the course of phagocytizing conidia by macrophage.

Penicillium m arnef fei;toll-like recep to r 9;DNA;RAW 264.7cell;chloroquine

R379

A

1002-2694(2011)06-0511-04

＊廣東省自然科學(xué)基金資助項目(8151008901000073)資助

張軍民,Email:junminmx@163.com

1.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚性病科,廣州 510120;2.江門市中心醫(yī)院皮膚科,江門 529030

2011-01-12;

2011-03-09