黃世勇 陶澤璋 肖伯奎

順鉑具有腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性和骨髓抑制等多種毒副作用[1]，劑量越大，其引發(fā)毒副作用的風(fēng)險也就越大，使其應(yīng)用受到一定的限制。臨床資料表明，大劑量順鉑可致雙耳進(jìn)行性感音神經(jīng)性聾，這是影響該藥使用乃至停藥的一個重要因素[2]。因此，在保留順鉑抗腫瘤作用的同時，如何降低其耳毒性，是臨床上一個亟待解決的課題。近年來有關(guān)順鉑的自由基致聾機(jī)制逐漸引起較多的關(guān)注，如何找到高效的抗自由基物質(zhì)，是當(dāng)前研究的一個熱點(diǎn)。連翹酯苷是從中草藥連翹中提取的一種單體物質(zhì)，為連翹的主要活性成分，具有顯著的清除氧自由基、抗氧化功效[3]。本研究在順鉑引發(fā)豚鼠內(nèi)耳損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察連翹酯苷對順鉑耳毒性的防護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，試圖為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物主要試劑及儀器 順鉑注射劑為齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號：910022208，10毫克/支；連翹酯苷凍干粉由天津一方科技有限公司提供，含量>98%，為淡黃色粉末狀物質(zhì)，批號100225，保存于4 ℃冰箱中，臨用前配制；超氧化物歧化酶活性試劑盒及丙二醛試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)器材：解剖顯微鏡(OLYMPUS SZS1)；MEM-3202型誘發(fā)電位儀(日本光電公司生產(chǎn)) ；配備單反數(shù)碼相機(jī)顯微攝影裝置的OLYMPUS E330研究級顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 成年健康豚鼠42只，雌雄不限，250～350 g，均經(jīng)電耳鏡檢查排除外耳道炎及中耳炎，耳廓反射靈敏。分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為3組，空白組(10只)：腹腔注射生理鹽水8．0 ml·kg-1·d-1，連續(xù)8天；順鉑組(16只)：將順鉑用生理鹽水配制成0.25 mg/ml，然后腹腔注射順鉑2．0 mg·kg-1·d-1，連續(xù)8天；拮抗組(16只)：前2天腹腔注射連翹酯苷25.0 mg·kg-1·d-1[4]，第3天起腹腔注射連翹酯苷后30 min，再腹腔注射順鉑2．0 mg·kg-1·d-1，連續(xù)8天。整個過程中避免接觸噪聲，每天測量體重以調(diào)整藥量并嚴(yán)密觀察豚鼠的毛發(fā)及精神狀況等變化。每組豚鼠首次用藥前及末次用藥后第二天行ABR閾值檢測，末次檢測完畢后，心臟穿刺采血[5]用于血清總超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase，T-SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測，最后斷頭處死取耳蝸，行硝酸銀染色全耳蝸鋪片觀察、耳蝸組織切片觀察及掃描電鏡觀察。

順鉑組6只、拮抗組3只動物因內(nèi)耳損傷、造模不成功以及死亡而未列入統(tǒng)計范圍內(nèi)。28個耳蝸用于硝酸銀染色全耳蝸鋪片及毛細(xì)胞定量觀察，其中，空白組8個、順鉑組8個、拮抗組12個；26個耳蝸用于耳蝸切片標(biāo)本制備，其中，空白組8個、順鉑組8個、拮抗組10個；12個耳蝸用于掃描電鏡樣品的制備，空白組4個、順鉑組4個、拮抗組4個。

1.3ABR檢測 1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg ) 腹腔注射麻醉，維持動物的自主呼吸，在隔聲電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。短聲刺激，刺激率為20次/秒，掃描時間10 ms，帶通濾波100～3 000 Hz ，聲輸出范圍0～100 dB nHL。記錄電極置于頭項(xiàng)正中，對側(cè)外耳道后壁為參考電極，鼻尖為地極[6]。

1.4全耳蝸鋪片及毛細(xì)胞定量觀察 耳蝸鋪片標(biāo)本制備：動物斷頭處死后，取出雙側(cè)聽泡，打開聽泡，蝸尖鉆孔，開放卵圓窗和圓窗，從蝸尖灌注新鮮配制的0.5%硝酸銀溶液2～3次，使液體自前庭階、鼓階由卵圓窗、圓窗流出，再用10%福爾馬林溶液灌注并將標(biāo)本置于固定液中，自然光下曝光2～3小時，解剖顯微鏡下剝離耳蝸蝸殼，取全程基底膜，放置于滴有甘油的載波片中，分回封片。在400倍光鏡下，觀察基底膜毛細(xì)胞形態(tài)，從蝸頂向底回逐個視野進(jìn)行計數(shù)外毛細(xì)胞。將基底膜的全長轉(zhuǎn)換為百分比長度表示，計錄每5%距離中的外毛細(xì)胞數(shù)量，同時將采集到的數(shù)據(jù)錄入計算機(jī)。記錄每個耳蝸樣品的數(shù)據(jù)，并將同組中不同樣品相應(yīng)單位百分比長度內(nèi)的外毛細(xì)胞數(shù)量與數(shù)據(jù)庫中該種屬健康動物相應(yīng)單位百分比長度內(nèi)的外毛細(xì)胞均數(shù)進(jìn)行比較，并轉(zhuǎn)換成該樣本外毛細(xì)胞的殘存率再組內(nèi)取均數(shù)，從而得出該組動物的耳蝸外毛細(xì)胞殘存率的曲線圖[7～11]。將三組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞殘存率曲線圖進(jìn)行對比并行定性和定量分析。

1.5耳蝸切片標(biāo)本制備 取各組動物聽泡，暴露耳蝸，蝸尖鉆孔，自蝸尖灌注10%福爾馬林溶液0.5～1.0 ml，將標(biāo)本置于同種固定液中4 ℃過夜。10%EDTA脫鈣一周。常規(guī)石蠟包埋，平行蝸軸方向連續(xù)切片，切片厚度約10 μm。行HE染色，封片，400倍光鏡下觀察Corti 器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)形態(tài)學(xué)情況，攝片[12]。

1.6掃描電鏡標(biāo)本制備 取各組動物聽泡，暴露耳蝸，蝸尖鉆孔，以2.5%戊二醛灌流，并置于相同固定液中，4 ℃過夜。次日清洗后在解剖顯微鏡下剝?nèi)ザ伖菤?，并輕柔剝下螺旋韌帶，暴露耳蝸基底膜，鋨酸處理，PBS清洗3次，梯度酒精脫水，100%醋酸異戊酯替換，CO2臨界點(diǎn)干燥，粘臺，噴金，2 500倍掃描電鏡下觀察攝片。

1.7血清T-SOD活性和丙二醛含量的測定 心臟穿刺采血，3 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存待測。檢測指標(biāo)包括血清總超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase，T-SOD)活性和丙二醛(malondialdhyde，MDA)含量。T-SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時對應(yīng)的SOD量為一個活性單位(1U)，結(jié)果以U/ml表示；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法，結(jié)果以nmol/ml表示[13]。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，ABR反應(yīng)閾行自身前后對照比較應(yīng)用配對t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素χ2分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組一般情況比較 空白組給藥前后精神狀況和日?；顒訜o明顯變化；順鉑組給藥期間動物活動減少，食欲減退，毛發(fā)豎立，疏松脫落，耳廓反射減退，甚至消失；拮抗組給藥期間也有輕度的毛發(fā)疏松，但活動、食欲、耳廓反射等變化較順鉑組明顯輕。

2.2各組ABR閾值比較 三組豚鼠給藥前后ABR閾值見表1。給藥前，三組豚鼠ABR閾值無明顯差異，給藥后，順鉑組和拮抗組豚鼠反應(yīng)閾較用藥前提高，順鉑組閾值增高更明顯。

表1 各組豚鼠給藥前后ABR閾值比較

注：△與同組給藥前比較，P<0.05；*與其余兩組給藥后比較，P<0.05

2.3全耳蝸鋪片毛細(xì)胞定量觀察

2.3.1耳蝸鋪片毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 各組內(nèi)毛細(xì)胞未見明顯損傷，損傷主要為外毛細(xì)胞。正常組毛細(xì)胞排列規(guī)則整齊，無缺失及損傷；拮抗組毛細(xì)胞排列規(guī)則，外毛細(xì)胞有散在缺失，纖毛結(jié)構(gòu)不清晰；順鉑組外毛細(xì)胞缺失數(shù)目增加，甚至成片缺失，外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂(圖1)。

2.3.2外毛細(xì)胞計數(shù)及殘存率 空白組外毛細(xì)胞完整未見明顯缺失(缺失率約1.0%)；順鉑組外毛細(xì)胞缺失最多且以底回最重，平均缺失率約53.42%，且外毛細(xì)胞缺失率自第一排向第三排逐漸增多，由頂回向底回逐步增加；拮抗組外毛細(xì)胞有散在缺失，程度介于空白組和順鉑組之間。各組動物外毛細(xì)胞殘存率見圖2，組間比較存在顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。各組內(nèi)毛細(xì)胞未見明顯缺失或損傷。

2.4耳蝸組織切片觀察 空白組未見明顯異常；拮抗組除了可見少許外毛細(xì)胞變性缺失外，血管紋無明顯異常，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度退變；而順鉑組除了外毛細(xì)胞缺失外，還可見Corti器的結(jié)構(gòu)紊亂、血管紋腫脹，血管擴(kuò)張，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖3)。

圖2 各組耳蝸鋪片外毛細(xì)胞殘存率比較

圖3 耳蝸組織切片觀察(HE染色，×400)(a～c為血管紋，d～f為螺旋神經(jīng)節(jié)，g～i為Corti器。a、d、g為空白組，b、e、h為順鉑組，c、f、i為拮抗組)

2.5掃描電鏡觀察結(jié)果 空白組耳蝸Corti器中，三排外毛細(xì)胞纖毛排列整齊，未見明顯缺失及損傷，順鉑組Corti器中，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛腫脹，外毛細(xì)胞倒伏，散亂，甚至呈片狀缺失；拮抗組Corti器中，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛腫脹呈簇，大部分外毛細(xì)胞排列稍有散亂，但未見明顯缺失；拮抗組毛細(xì)胞損傷程度介于空白組和順鉑組之間(圖4)。

圖4 各組耳蝸毛細(xì)胞掃描電鏡觀察

2.6血清T-SOD活性和MDA含量比較 拮抗組T-SOD活性較空白組顯著下降，MDA含量較空白組顯著升高(P<0．05)；順鉑組T-SOD活性低于拮抗組，而MDA含量高于拮抗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。

表3 各組豚鼠血清T-SOD活性和MDA含量比較

注：*與其余兩組比較，P<0.05

3 討論

豚鼠順鉑耳毒性造模過程中，順鉑劑量不宜過大或過小，否則很容易導(dǎo)致豚鼠在出現(xiàn)耳毒性損害之前便因腎毒性而死亡。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 mg·kg-1·d-1是合適的劑量，一般用藥后4天左右蝸底即出現(xiàn)毛細(xì)胞損傷，到第5至6天，毛細(xì)胞缺失與正常未處理組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異。本實(shí)驗(yàn)觀察到動物連續(xù)腹腔注射順鉑8天，基底膜底回外毛細(xì)胞損傷明顯，達(dá)50%以上，而此時豚鼠死亡率相對較低，僅30%左右，故認(rèn)為2 mg·kg-1·d-1腹腔注射8天是合適的，既造成了基底膜較大范圍的損傷，使豚鼠ABR反應(yīng)閾明顯增高，又不至于使豚鼠的死亡率過高。

順鉑耳毒性的作用機(jī)制目前尚未完全闡明，一般認(rèn)為機(jī)制主要有以下幾種：內(nèi)耳蓄積的直接損傷、對內(nèi)耳代謝的影響、血清電解質(zhì)平衡改變、氧化應(yīng)激損傷[14]。其中，氧化應(yīng)激損傷尤為重要。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的諸多防護(hù)劑均與拮抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。如硫代硫酸鈉、蛋氨酸、谷胱苷肽等，其機(jī)制主要為清除耳蝸組織氧自由基，減輕因氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的耳蝸組織細(xì)胞損傷[15]。

連翹酯苷為從連翹中提取的一種單體物質(zhì)，為連翹的主要活性成分，具有顯著的清除組織的氧自由基、抗氧化功效[3]。然而，連翹酯苷能否通過清除耳蝸氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而對順鉑的耳毒性起防護(hù)作用，尚未見報道。故本實(shí)驗(yàn)在建立順鉑導(dǎo)致豚鼠內(nèi)耳損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察連翹酯苷對順鉑耳毒性的防護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，順鉑耳毒性主要累及外毛細(xì)胞，其損害首先從耳蝸底回開始并逐漸向蝸頂發(fā)展，基底膜底回外毛細(xì)胞破壞嚴(yán)重，可達(dá)50%以上，越靠近蝸頂損傷越輕；血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)也多有累及,主要表現(xiàn)為血管紋腫脹和血管擴(kuò)張，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目明顯減少。而連翹酯苷可部分拮抗順鉑對內(nèi)耳組織的損傷，這在拮抗組和順鉑組兩組間外毛細(xì)胞損傷的比較上較為明顯，在底回基底膜，順鉑組外毛細(xì)胞缺損率高達(dá)50%以上，而拮抗組外毛細(xì)胞缺損率僅在40%以下；另外，連翹酯苷還可明顯減輕由順鉑導(dǎo)致的外毛細(xì)胞腫脹，同時拮抗組血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)所受的損傷也相對較小。

自由基包括氧自由基和氮自由基，正常狀態(tài)下，耳蝸內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基與耳蝸內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)保持動態(tài)平衡[16]。生理狀態(tài)下各種自由基具有很高的生物活性，可產(chǎn)生許多生理功能，但當(dāng)自由基生成過多或其清除系統(tǒng)功能下降時將蓄積過多的自由基，從而對機(jī)體產(chǎn)生損傷[17]。SOD是抗過氧化的重要酶，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著關(guān)鍵作用，它可以清除超氧化物陰離子，保護(hù)毛細(xì)胞免受損傷，還可以使脂質(zhì)過氧化物還原為相應(yīng)的醇，減少自由基的生成，它的含量可以反映順鉑耳中毒時脂質(zhì)過氧化的作用的強(qiáng)弱；氧自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并因此生成過多的脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致其代謝終產(chǎn)物MDA含量顯著增多。因此，T-SOD活性和MDA含量的測定可間接反映耳蝸組織在順鉑耳毒性時清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑組動物耳蝸組織中T-SOD活力明顯低于正常對照組(P<0.05)，表明機(jī)體清除自由基的能力顯著下降，提示超氧陰離子自由基含量明顯增多。拮抗組豚鼠ABR閾值較順鉑組明顯降低，T-SOD含量較順鉑組明顯升高，MDA含量明顯降低，提示連翹酯苷可能通過增強(qiáng)體內(nèi)清除氧自由基的能力，降低耳蝸內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕因氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的耳蝸組織細(xì)胞損傷，從而說明連翹酯苷可拮抗順鉑耳毒性，對聽力有一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果增進(jìn)了對連翹酯苷藥理作用的認(rèn)識，為其臨床應(yīng)用提供了新的思路。

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