夏樹前 龔樹生 李嬌 張富剛

內(nèi)耳動脈似彈簧螺旋樣走行，血流經(jīng)過這種極端彎曲的血管后，一方面變得緩慢而平穩(wěn)，另一方面，彈簧樣結(jié)構(gòu)是保持局部血流自我調(diào)節(jié)穩(wěn)定的生理結(jié)構(gòu)基礎，再加上血管路徑較長，易發(fā)生血流淤滯和脂質(zhì)沉積，故易發(fā)生阻塞。疑為缺血引起的內(nèi)耳病變，經(jīng)顳骨解剖觀察，僅少數(shù)出現(xiàn)完全動脈阻塞的病理變化，可能為一過性內(nèi)耳血流受阻后又部分或完全恢復，即發(fā)生了缺血再灌注。組織器官缺血再灌注損傷中均發(fā)現(xiàn)有鈣離子內(nèi)流，細胞鈣超載，從而導致細胞凋亡，抑制鈣離子內(nèi)流以期抑制細胞凋亡是目前研究的熱點。尼莫地平作為鈣離子拮抗劑，在心腦等器官缺血再灌注損傷中具有良好的保護作用，本研究旨在探討尼莫地平對耳蝸缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 選取42只豚鼠，雌雄不拘，隨機分為：實驗組18只，尼莫地平干預組18只，對照組6只。實驗組與干預組按ABR檢測時間及斷頭取聽泡時間又分為再灌注1、2和6 h 3個時間點，每一時間點6只豚鼠。對照組6只豚鼠不造模，作為空白對照。

1.2實驗儀器及試劑 激光多普勒血流量儀(Periflux System 5000,Perimed,瑞典)，視窗版perisoft軟件分析數(shù)據(jù)，ABR檢測儀(Bio-logic Systems 美國)。FeCl3(三氯化鐵，天津化學試劑三廠)，分析純，配成40%水溶液；尼莫地平(德國拜耳股份有限公司)，用量為0.5 mg/kg。

1.3實驗方法

1.3.1缺血再灌注模型的制備 實驗組與干預組豚鼠腹腔注射6%水合氯醛0.6 ml/100 g，麻醉后動物仰臥于手術(shù)臺，頭架固定頭部，頸前正中氣管切開，插管，自主呼吸。自氣管旁進路，分離附著于顱底的肌肉組織，暴露枕部顱底，于右側(cè)顱底用電鉆磨開一約2 mm×4 mm骨窗，刺破硬、軟腦膜，暴露小腦前下動脈。將浸有5 μl 40%FeCl3的濾紙覆蓋于小腦前下動脈上，5分鐘后撤除濾紙，生理鹽水沖洗局部。連續(xù)記錄耳蝸血流量(cochlear blood flow,COBF)變化，30分鐘后COBF不再下降并穩(wěn)定，標志血栓形成。干預組在應用FeCl310分鐘前經(jīng)頸外靜脈注射尼莫地平0.5 mg/kg,實驗組注射等量生理鹽水，正常對照組不注射任何藥物。小腦前下動脈血栓形成后，生理鹽水稀釋尿激酶至1×104U/ml,干預組和實驗組于頸外靜脈給予尿激酶4 000 U/kg緩慢推注，30分鐘后COBF不再上升且穩(wěn)定，標志血栓溶解、血流再灌注。

1.3.2耳蝸血流量測量方法 打開右側(cè)聽泡，暴露耳蝸，三維固定儀固定激光多普勒流量儀探針型探頭，使探頭尖端輕輕接觸耳蝸底回外側(cè)壁，測量耳蝸血流，穩(wěn)定三分鐘后連續(xù)記錄，結(jié)果以PSW軟件分析數(shù)據(jù)輸出。

1.3.3ABR檢測方法 干預組和實驗組分別在缺血前、再灌注1、2、6 h時行ABR檢測，對照組行一次ABR檢測。同上法麻醉豚鼠，電極皆用直徑0.38 mm、長13 mm的針灸針，記錄電極置于雙側(cè)耳廓前緣連線中點的頭頂皮下，參考電極置于同側(cè)耳垂皮下，鼻尖部接地。刺激聲為click,升降時間1 ms，平臺期10 ms，交替波，帶寬為100～1 500 Hz,刺激重復率為11次/秒，平均疊加300次，掃描時間10 ms,間期100 μs,聲刺激強度以120 dB SPL開始，每10 dB一檔減至閾值上下，然后5 dB一檔升降確定閾值，以能引出明確的可重復波Ⅲ的最小刺激聲強度作為閾值。

1.3.4耳蝸基底膜鋪片及熒光染色 各組于ABR測試完畢后，斷頭取聽泡，經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定1小時后，于10 mmol/L PBS(pH7.4)中分離基底膜，平鋪于玻片上，將濃度為10 μg/ml Hoechest33342 熒光染料 25 μl滴加在每一只標本上，避光30分鐘，PBS沖洗三遍后，50%甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)學變化。

1.3.5免疫組織化學染色觀察螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡因子Casepase-3變化 10%水合氯醛溶液腹腔注射30 mg/kg,仰臥固定，開胸暴露心臟，灌流沖洗，隨后灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)500 ml。將豚鼠迅速斷頭，快速取出耳蝸，在蝸頂鉆孔并挑破圓窗膜和卵圓窗，用上述固定液重復進行耳蝸灌流至少5 次后，放入相同固定液中，4 ℃過夜。修剪后置入10%乙二胺四乙酸二鈉充分脫鈣3周左右,梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，耳蝸中軸5 μm連續(xù)切片。Caspase-3免疫組化染色：耳蝸組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2孵育10 min，蒸餾水沖洗。滴加抗原修復液1～3滴，孵育10 min，，蒸餾水沖洗。10%正常羊血清封閉20 min；實驗組和干預組滴加兔多抗Caspase-3抗體(1：200),4 ℃過夜，對照組用正常羊血清代替一抗；加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗三次，滴加鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)反應液1～2滴，37 ℃二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色； Mayer蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明、封片，顯微鏡(10×40)視野觀察照相。以上試劑均由北京中山公司提供。

1.3.6圖像分析處理 Caspase-3染色切片由新9．0版HPIAS-100高清晰度彩色病理圖像免疫組化測量系統(tǒng)，在40倍視野下，每張切片隨機取5個視野，測量每組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的平均吸光度。各組動物于400倍光鏡下在耳蝸底回末段和第二回起始段分別取三個視野計數(shù)缺損內(nèi)毛細胞(缺失和損傷細胞)，并計算內(nèi)毛細胞缺損率(缺失加損傷細胞核與原有細胞核的比例)。

1.4統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計包處理。采用重復測量資料方差分析進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1耳蝸血流量監(jiān)測 各組耳蝸血流量見表1，可見，栓塞30分鐘時實驗組和干預組耳蝸血流量較各組缺血前及對照組明顯降低，再灌注后耳蝸血流量又有所回升，但仍較缺血前低，說明造模成功。耳蝸缺血再灌注前后，實驗組與干預組耳蝸血流量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2ABR檢測結(jié)果 各組ABR閾值變化見表2，可見，缺血前實驗組、干預組、對照組的ABR閾值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，再灌注后干預組ABR閾值較實驗組明顯降低(P<0.01)，較對照組和缺血前仍明顯升高(P<0.01)。

表1 各組不同時間點耳蝸血流量

表2 各組不同時間點ABR閾值

注：*與缺血前及實驗組同時間點比較，P<0.01

2.3耳蝸基底膜鋪片及熒光染色 對照組各回均有整齊排列的三排外毛細胞和一排內(nèi)毛細胞，毛細胞無缺失，實驗組和干預組外毛細胞未見明顯的細胞核形態(tài)異常，內(nèi)毛細胞均有不同程度的丟失及細胞核形態(tài)異常，各回基底膜中內(nèi)毛細胞的損傷以底回為最，其次為第二回(圖1)。各組各時間點內(nèi)毛細胞缺損率見表3，實驗組與干預組在同一時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Casepase-3免疫組化染色 實驗組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)內(nèi)有染色程度不同的棕黃色顆粒分布，并隨時間的延長逐漸增加，以再灌注6 h最多，干預組各時間點SGC有少量細胞質(zhì)棕黃色顆粒分布，表達趨勢同實驗組，對照組染色陰性(圖2)。圖像分析各組平均吸光度值見表3，干預組和實驗組各個時間點差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 各組各時間點內(nèi)毛細胞缺損率和耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Caspase-3平均吸光度值

注：*與實驗組比較，P<0.01

3 討論

內(nèi)耳缺血或栓塞可影響內(nèi)耳的功能，自身免疫性疾病、感染、噪聲、耳毒性藥物等也可引起內(nèi)耳缺血或缺血再灌注，從而引起內(nèi)耳毛細胞和神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，導致耳聾或眩暈。

耳蝸由基底動脈的分支小腦前下動脈供血，小腦前下動脈屬于終末動脈，無側(cè)枝循環(huán)，發(fā)生阻塞時，不能由其他動脈的供血加以補償，因而易造成耳蝸缺血。相對于部分研究者[1]通過栓塞雙側(cè)椎動脈，以微動脈夾鉗夾—松開一側(cè)頸總動脈來完成耳蝸缺血再灌注的造模方法， 本實驗用FeCl3誘導小腦前下動脈血栓形成，以尿激酶溶解，更符合生理實際，并通過激光多普勒檢測耳蝸血流的變化，客觀地反映了耳蝸缺血再灌注變化過程。本實驗結(jié)果顯示，使用FeCl330分鐘時，耳蝸血流量顯著降低；再灌注1 h后，耳蝸血流量有所回升，動物ABR反應閾急劇升高，表明造模成功、可靠。

DNA熒光染料(PI或Hoechest33342)是一種快速、簡便、可靠的方法，可用于定量檢測壞死和凋亡的毛細胞[2]。而Casepase-3是casepase家族中重要一員，一般認為它是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，是細胞凋亡的執(zhí)行者[3]，它的出現(xiàn)標志著細胞凋亡。因此，本試驗選取DNA熒光染料染色和Casepase-3免疫組化法分別觀察耳蝸缺血再灌注過程中毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞變化。結(jié)果顯示，實驗組外毛細胞核幾乎無形態(tài)學上的變化，部分內(nèi)毛細胞核固縮、缺失。Taniquchi[4]通過對豚鼠耳蝸缺血再灌注實驗發(fā)現(xiàn)，耳蝸缺血再灌注30 min后即有內(nèi)毛細胞核固縮，再灌注1 h即有核缺失，并且在24 h之內(nèi)隨時間延長缺失率上升，與本實驗結(jié)果一致。本研究實驗組缺血再灌注1、2、6 h螺旋神經(jīng)節(jié)細胞均有大量Casepase-3表達，并且隨著時間的延長而增加，表明在耳蝸缺血再灌注條件下，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)促凋亡因素極為活躍，說明耳蝸缺血再灌注早期，內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生凋亡。

圖1 各組耳蝸毛細胞核Hochest33342染色 a、b、c分別為實驗組再灌注后1、2、6 h毛細胞核Hochest33342染色，d、e、f分別為對干預組再灌注后1、2、6 h毛細胞核 Hochest33342染色；g為正常對照組。 ★表示細胞核缺失，(→)表示細胞受損(細胞核固縮)。(共聚焦顯微鏡×400)

圖2 各組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Caspase-3免疫組織化學染色 a、b、c為實驗組1、2、6 h螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase-3免疫組織化學染色，d、e、f為干預組1、2、6 h，g為正常對照組。箭頭表示Caspase-3免疫組織化學染色陽性細胞(SABC×400)

關(guān)于耳蝸缺血再灌注的損傷機制，目前尚無定論。研究表明，耳蝸Cort器、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中存在親離子谷氨酸受體AMPA(α-氨基羥甲基惡唑丙酸)，Corti器中AMPA受體位于內(nèi)毛細胞和傳入神經(jīng)樹突之間的軸突上，缺血再灌注后，刺激耳蝸內(nèi)毛細胞和鄰近的支持細胞釋放大量的谷氨酸，激活AMPA受體，引起內(nèi)毛細胞鈣離子內(nèi)流[5～7]。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞除存在AMPA受體外，還存在ryanodine受體及 ryanodine受體門控的鈣池，這種鈣池有助于與聽覺神經(jīng)傳導通路有關(guān)的鈣離子信號傳導[8]，缺血時，內(nèi)流的鈣離子激活ryanodine受體，導致鈣池鈣離子釋放[9]。另外，耳蝸缺血再灌注還可引起細胞膜鈣離子ATP酶(PMCA)失活，不能有效地泵出鈣離子[10]。通過上述機制，最終引起細胞內(nèi)鈣超載，從而導致細胞發(fā)生凋亡。

以往使用尼莫地平對心腦等器官缺血再灌注的研究表明，尼莫地平對缺血再灌注的作用為：①抑制鈣離子內(nèi)流，減輕線粒體鈣超載，抑制線粒體氧化磷酸化藕聯(lián)，從而恢復ATP生成[11]；②減輕細胞內(nèi)乳酸酸中毒：當細胞內(nèi)pH值下降和鈣積聚時，細胞通過鈉—氫泵和鈉—鈣交換排出鈣離子，因鈣離子內(nèi)流被抑制，使鈉-鈣交換減少，鈉—氫交換相對增加，而排出更多氫離子；而對線粒體功能的保護亦抑制了乳酸的生成[12]。Schnee等[13]研究離體耳蝸外毛細胞鈣離子電流時發(fā)現(xiàn)，尼莫地平可部分阻斷海龜耳蝸毛細胞電壓依賴性鈣電流，減輕細胞內(nèi)鈣離子負荷，其抑制率與尼莫地平濃度有關(guān)。本實驗干預組使用尼莫地平后，內(nèi)毛細胞缺失減少，螺旋神經(jīng)節(jié)Casepase-3表達下調(diào)，ABR反應閾較實驗組明顯降低，表明作為一種L型電壓門控性鈣通道阻滯劑，尼莫地平可能通過抑制鈣離子內(nèi)流從而直接或間接抑制促凋亡基因的表達，最終對缺血再灌注后的耳蝸起到有效的保護作用。

鈣通道阻滯劑尼莫地平作為降壓和擴管藥物，應用于心腦血管疾病方面取得了良好的療效，目前在耳科應用方面，大部分人仍然把它作為改善內(nèi)耳血供的藥物使用。但有學者[14]在豚鼠耳蝸缺血后使用尼莫地平，發(fā)現(xiàn)其并不能改善耳蝸血流，據(jù)此認為內(nèi)耳缺血時不宜使用尼莫地平。本試驗結(jié)果也證實尼莫地平無法有效的增加耳蝸血流，但并不能由此否定其對耳蝸缺血再灌注損傷的保護作用。另外，尼莫地平的濃度可能也是一個關(guān)鍵因素，有報道一定量尼莫地平會導致血管內(nèi)皮細胞損傷，從而加重缺血再灌注時耳蝸細胞的損傷。本實驗所用尼莫地平的濃度參閱多篇文獻，并在預試驗中反復試驗，確保了作為保護劑的合理濃度。至于尼莫地平干預組與正常對照組ABR反應閾之間仍有統(tǒng)計學差異，表明尼莫地平還不能對缺血再灌注損傷起到完全預防保護作用，其機制尚有待進一步研究。

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