華清泉 董昶劉陽 林偉 孫建軍

梅尼埃病是一種以膜迷路積水為基本病理改變的特發(fā)性內(nèi)耳疾病，由于目前的臨床檢查對其診斷價值的特異性不高且無法行內(nèi)耳活檢，故其診斷主要依據(jù)病史及典型癥狀。目前對梅尼埃病客觀診斷研究的熱點是鼓室局部注射核磁造影劑后掃描區(qū)分顯影內(nèi)、外淋巴液，從而從影像學(xué)角度直接觀察內(nèi)淋巴是否積水。2004年Duan[1]首次通過豚鼠圓窗膜局部浸潤核磁造影劑的方式觀察內(nèi)耳增強顯影，繪制了耳蝸各階內(nèi)的圖像信號強度隨時間變化圖。受此實驗啟發(fā)，若能獲得圖像增強信號強度與造影劑濃度間的某種相關(guān)關(guān)系，即能將增強信號強度-時間變化圖轉(zhuǎn)化為造影劑在內(nèi)耳的濃度-時間變化圖。本實驗通過體外試驗探索磁共振信號增強強度與造影劑濃度間的關(guān)系，從而為鼓室局部注射造影劑后的內(nèi)耳藥物代謝特征研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)注射液(馬根維顯：德國拜耳公司,0.5 mmol/ml)；生理鹽水；15 ml離心管；加樣槍；恒溫水箱；GE 3.0T核磁共振儀及膝關(guān)節(jié)線圈；泡沫試管固定架等。

1.2不同濃度釓噴酸葡胺溶液的配制 濃度設(shè)計按兩組進行，即分別以1.5 mmol/L(臨床應(yīng)用增強較理想濃度)為中心分別按等差(0.25 mmol/L遞增)及等比數(shù)列(1：2倍增)配制兩組Gd-DTPA濃度組：①0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75 mmol/L；②0.046 875、0.093 75、0.187 5、0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、12、24、48 mmol/L；另增加1只空白對照管，共21只試管(濃度重復(fù)僅配一只試管)。

1.3核磁掃描 將各離心管外壁擦干置于泡沫試管架中固定后，將試管架置于膝關(guān)節(jié)線圈中心；核磁掃描在3.0 T核磁掃描儀(美國GE通用電氣公司)下進行。使用3D-T1 FSE序列(Fast Spin Echo Sequence)，掃描參數(shù)如下：TE(effective)=33.9 ms，TR=520 ms，帶寬(bandwidth)=50 kHz，掃描層厚=1.2 mm，層距=0.9 mm，F(xiàn)OV=8*4 cm，矩陣=256*224，激勵次數(shù)(NEX)=6，使用脂肪抑制、ZIP 512及ZIP*4重建技術(shù)，共重建32層，掃描時間為5分1秒。

1.4數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計學(xué)方法 使用GE工作站對核磁圖像行信號強度的提取，ROI(region of interest)選擇各離心管橫截面中心部位，直接讀取各離心管信號強度(signal intensity，SI，以灰度值表示)；使用Excel(Microsoft office 2003)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，以造影劑濃度為橫軸，SI為縱軸繪出散點圖并分別進行兩變量的相關(guān)與回歸分析，使用SPSS17.0行回歸方程的方差分析。

2 結(jié)果

離心管核磁掃描結(jié)果見圖1。完成圖像信號提取記錄結(jié)果分別見表1、表2。以兩組造影劑濃度(mmol/L)為橫軸,以SI為縱軸繪出散點圖后發(fā)現(xiàn)：在濃度遞增組，當(dāng)造影劑濃度≤1 mmol/L時SI呈線性增加，在1～1.5 mmol/L范圍內(nèi)SI不增反而輕度下降，濃度在1.5～2.0 mmol/L時SI再次上升，2.0～2.75 mmol/L范圍內(nèi)再次下降；在濃度倍增組，當(dāng)造影劑濃度≤0.75 mmol/L時SI呈線性增加，當(dāng)濃度繼續(xù)倍增時SI快速下降。初步推測在造影劑較低濃度范圍內(nèi)(≤1 mmol/L)，SI與其呈線性關(guān)系。

提取兩組中造影劑濃度小于1 mmol/L的SI (不包括空白對照管)再次分別繪制散點圖(圖2，并示決定系數(shù)r2與回歸方程)后發(fā)現(xiàn)，隨著造影劑濃度的增加，磁共振信號強度隨之呈線性增加。SI與造影劑濃度關(guān)系計算得出決定系數(shù)r2=0.96并得出回歸方程Y=23 388X+8 120.1(F=138.07，P<0.01)，證明兩者的相關(guān)性良好，兩者之間存在線性關(guān)系。

圖1 離心管掃描MRI圖像

編號1為空白鹽水對照，2為濃度為0.25 mmol/L的稀釋造影劑，余濃度依次為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、0.046 875、0.093 75、0.187 5、0.375、3.0、6.0、12、24和48 mmol/L

表1 濃度遞增組SI

表2 濃度倍增組SI

圖2 SI與造影劑濃度線性關(guān)系，并示回歸方程與決定系數(shù)

3 討論

傳統(tǒng)研究鼓室局部給藥后的內(nèi)耳藥物代謝動力學(xué)的方法主要分如下幾類：①將藥物與免疫、放射性或熒光分子結(jié)合后局部注射，取出聽泡后制作內(nèi)耳切片，然后使用免疫組織(細(xì)胞)化學(xué)[2，3]、放射自顯影[3]等技術(shù)來半定量的研究藥物在內(nèi)耳的分布；②鼓室給藥后通過抽取淋巴液，使用高效液相色譜[4]、放射性免疫測定法[5]等微量檢測法直接測定藥物濃度；③耳蝸內(nèi)植入探針進行實時監(jiān)測[6]。但傳統(tǒng)的方法存在著如下不足：第一類測定方法僅是半定量的研究，其次由于制作切片過程中固定劑(如石蠟)的置換作用無法獲得尚存于淋巴液中的藥物，觀察到的只是進入內(nèi)耳各細(xì)胞及細(xì)胞間隙中的藥物分布信息，另外此方法所獲得的僅是離體的斷層信息；第二類方法則受淋巴液量微少、抽取過程極易受血液及腦脊液污染的影響，其結(jié)果的可靠性顯著降低，另外尚有研究表明藥物在耳蝸中存在著梯度分布現(xiàn)象[7]，直接測定濃度將無法觀察到梯度分布；第三類方法則是通過實時監(jiān)測耳蝸植入探針內(nèi)溢出的淋巴液來測定藥物濃度，由于外淋巴液量微少、所取樣本中的藥物并非生理性的藥物清除，因而此法并不能完全顯示出外淋巴液藥物動力學(xué)的規(guī)律[8]。受研究手段限制，至今尚無一種能同時滿足活體、動態(tài)、實時、可重復(fù)、連續(xù)觀察、非侵襲性的研究方法。

自2007年日本學(xué)者Nakashima[9]首次通過內(nèi)耳核磁增強顯影觀察到梅尼埃病患者的內(nèi)淋巴積水以來，至今全世界學(xué)者已行內(nèi)耳增強顯影數(shù)百上千例，雖未見相關(guān)副反應(yīng)報道，但經(jīng)鼓室給藥作為一種新型給藥途徑(相比常規(guī)靜脈注射)其在內(nèi)耳的代謝特點尚未被研究。不僅僅是Gd-DTPA，由于技術(shù)手段的限制至今尚無一種藥物的內(nèi)耳代謝特性被完全了解，致使鼓室給藥治療內(nèi)耳疾病受到了極大的限制。DTPA(二乙基三胺五乙酸)為高效螯合物，與Gd3+結(jié)合不僅降低了游離釓離子的毒性、增加了其水溶性，而且使其弛豫性更強。學(xué)者們利用DTPA的特性將其與藥物或生物大分子結(jié)合，如脫氧葡萄糖[10]、單抗[11]、葉酸[12]等結(jié)合后再與釓離子螯合后來進行核磁的靶向性顯影研究，市面上亦出現(xiàn)專門提供Gd-DTPA標(biāo)記的試劑盒(BioPAL公司)。雖目前尚未見Gd-DTPA與內(nèi)耳疾病治療相關(guān)藥物如慶大霉素、地塞米松等藥物耦合的報道，但相信技術(shù)上應(yīng)該不難實現(xiàn)。由此可見，使用Gd-DTPA標(biāo)記藥物分子同時具有進行藥物代謝動力學(xué)研究的潛在價值。

總結(jié)本次實驗存在的不足和需要進一步深入研究的內(nèi)容如下：①因本實驗為體外實驗，僅單純研究生理鹽水配制的不同濃度的造影劑與圖像增強信號間的關(guān)系，內(nèi)耳外淋巴液環(huán)境中的各種離子、蛋白質(zhì)，淋巴液周圍組織(如蝸殼的骨質(zhì))是否會對體外試驗所得線性關(guān)系產(chǎn)生影響需進一步探明；②Gd-DTPA濃度與灰度值之間轉(zhuǎn)換存在著應(yīng)用范圍，即在濃度在0～1 mmol/L范圍內(nèi)時線性關(guān)系才存在，在內(nèi)耳濃度積聚超過此濃度有無彌補的轉(zhuǎn)換方法；③將Gd-DTPA標(biāo)記于藥物分子后，各種藥物分子是否會對Gd-DTPA的弛豫縮短效應(yīng)產(chǎn)生影響也需要進一步研究證明。

總之，利用核磁造影劑的示蹤劑特性及核磁圖像灰度與濃度之間良好的線性關(guān)系建立起來的內(nèi)耳藥物代謝動力學(xué)研究是繼傳統(tǒng)內(nèi)耳藥物代謝方法研究后的又一嘗試，動物實驗結(jié)果及其臨床推廣將會為鼓室給藥途徑治療內(nèi)耳疾病提供理論支撐及依據(jù)。

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