李勝利 趙謙 任田英 張少強(qiáng) 閆利英 劉思偉 王婉瑩 朱宏亮

全世界蝙蝠種類繁多，有1 100多個(gè)品種，占地球上哺乳動(dòng)物的五分之一以上，大多數(shù)蝙蝠依靠回聲定位進(jìn)行導(dǎo)航和捕食，其最顯著的特征是具有敏銳的聽覺和纖細(xì)調(diào)諧分析多普勒頻移回聲(CF2)的功能。因此，其耳蝸明顯出現(xiàn)了有別于非回聲定位蝙蝠和哺乳類動(dòng)物的特化現(xiàn)象，集中表現(xiàn)在耳蝸基底膜上和(中樞)下丘出現(xiàn)極度擴(kuò)展從而得到極度表達(dá)的區(qū)域，被稱之為“聲黃斑” (acoustic fovea)[1～5]，也有作者稱之為“聽黃斑”(auditory fovea)[6～8]，Russell等[9]曾測定髯蝠稱之為耳蝸斑(cochlear fovea)。普遍認(rèn)為哺乳類動(dòng)物的耳蝸外毛細(xì)胞(OHC)胞體運(yùn)動(dòng)和/或纖毛束運(yùn)動(dòng)在耳蝸放大器機(jī)制中起重要作用[10]，而蝙蝠的OHC卻不具備耳蝸放大器功能，恰好相反，它在最佳頻率起限制和阻抗基底膜放大的作用。有關(guān)回聲定位蝙蝠耳蝸的蓋膜(tectorial membrance ,TM)和基底膜(basilar membrane, BM)及附著結(jié)構(gòu)與聽黃斑的生理關(guān)系已進(jìn)行了較多研究[3，7，9，11～15],但對聽黃斑區(qū)的毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究較少[4，16～19]。為探討回聲定位蝙蝠與哺乳動(dòng)物耳蝸機(jī)制上差異的原因，本研究觀察了蹄蝠、菊頭蝠和犬吻蝠耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)的超微結(jié)構(gòu)，以了解回聲定位蝙蝠聽黃斑區(qū)的毛細(xì)胞形態(tài)特征，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 從陜西柞水縣溶洞捕捉百余只蝙蝠，品種經(jīng)中國科學(xué)院動(dòng)物研究所鑒定有三種：蹄蝠(Hipposiderid)、菊頭蝠(Rhinolophus)和犬吻蝠(Molossidae)。用12只C57小鼠、20只豚鼠和6只棕色田鼠耳蝸?zhàn)鳛閷φ?。蝙蝠捕獲時(shí)間及觀察品種和數(shù)量見表1。

表1 不同時(shí)間觀察的蝙蝠的種類、數(shù)量和性別

1.2聽功能檢測 三種蝙蝠各取10只分別測試ABR，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，置于屏蔽室內(nèi)，顱頂為記錄電極，參考電極在測試耳乳突部，接地電極接鼻尖。以鍍有銀化物的專用電極刺入約0.5 mm，保證針刺電極的極間電阻在1 kΩ左右(不超過3 kΩ)，由RA4LI模塊自帶電阻檢測顯示。

蝙蝠在實(shí)驗(yàn)過程中被固定于屏蔽室內(nèi)的記錄臺(tái)上，并保證受測耳與喇叭的位置固定距鼓膜2～3 cm。Tucker-Davis Technologies TDT System Ⅲ用于聽覺刺激信號(hào)的發(fā)送和采集。

本儀器配置TDT RP2.1 實(shí)時(shí)信號(hào)處理器，刺激聲為TDT軟件自帶的Black man短純音修改的2 ms短純音(tone burst)，以每秒21.01次刺激率由Tucker-Davis Technologies TDT System Ⅲ的RX5模塊產(chǎn)生，經(jīng)RP2.1模塊在PA5衰減后由TDT ED1 Electrosatatic Speaker Driver驅(qū)動(dòng)靜電場揚(yáng)聲器發(fā)聲，頻率范圍2～100 kHz，分別為2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96和100 kHz，由TDT PA5以 5 dB梯度強(qiáng)度從100 dB向0 dB自動(dòng)衰減，前置放大增益100 k，RX5-2 數(shù)字濾波。帶通濾波100～3 000 Hz，疊加500～1 000次，純音刺激間期2 ms，上升和下降時(shí)間1 ms，以波Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ的出現(xiàn)或消失(<1 μV)為標(biāo)志波進(jìn)行測試。信號(hào)的疊加在TDT硬件系統(tǒng)和BiosigRP幫助下進(jìn)行。

1.3耳蝸電鏡標(biāo)本制作及觀察方法 在檢測聽功能后，將處于麻醉狀態(tài)的蝙蝠快速斷頭處死，取出雙側(cè)聽泡，在手術(shù)顯微鏡下暴露出耳蝸，用細(xì)鋼針挑破蝸頂和耳蝸底回圓窗及卵圓窗，快速灌入2.5%戌二醛PBS 液，4 ℃固定4 h ，1.0%鋨酸固定2 h，PBS 洗滌后在手術(shù)顯微鏡下去除耳蝸骨殼、蓋膜及部分血管紋組織，充分暴露出Corti器上的基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞。梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，定位后掃描電鏡(SEM)標(biāo)本在VegaC Tescan(捷克，SEM MAG: 49X)和高分辨SEM-3010(日立)上觀察；透射電鏡樣品用EPON618平板包埋，LDB5型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾及硝酸鉛復(fù)染，日立680型電鏡觀察。

觀察方法：按照K?ssl和Vater觀察髯蝠的方法[15，17]，從耳蝸基底到頂端的距離，將耳蝸分為SI區(qū)(sparsely innervated，SI)和CF2區(qū)(second harmonic constant-frequency component of the echolocation call,CF2)及溝回區(qū)(Hook)，將基底膜分成基底、頂回和斑區(qū)(foveal)片段，進(jìn)行光鏡和電鏡觀察。觀察耳蝸聽黃斑的位置，即從耳蝸基底端向頂端的20%～45%為觀察SI區(qū)位置，由46%～75%為觀察CF2區(qū)的位置，整個(gè)SI區(qū)和CF2區(qū)均為聽黃斑區(qū)(圖1)，其它部位觀察用于對照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad.Prism5統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用Newman-Keuls Multiple Comparison Test對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，比較數(shù)據(jù)的可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1三種正常回聲定位蝙蝠ABR測試結(jié)果 在2～12 kHz，三種回聲定位蝙蝠的ABR反應(yīng)閾均較高，在35 dB SPL以上；犬吻蝠的ABR反應(yīng)最敏感，其波幅最大及調(diào)諧最敏銳頻率在20～28 kHz范圍，其反應(yīng)閾在10 dB SPL左右；菊頭蝠的ABR反應(yīng)最敏感和波幅最大及調(diào)諧最敏銳頻率在83～86 kHz范圍內(nèi)；蹄蝠的ABR反應(yīng)最敏感和波幅最大及調(diào)諧最敏銳頻率在60～62 kHz范圍內(nèi)；由圖2可以看到三種蝙蝠的聽黃斑最敏銳調(diào)諧頻率位置和ABR反應(yīng)閾及頻率位置。

2.2掃描電鏡觀察耳蝸聽黃斑區(qū)毛細(xì)胞形態(tài)

2.2.1中蹄蝠耳蝸聽黃斑區(qū)毛細(xì)胞形態(tài)觀察 三種回聲定位蝙蝠的耳蝸相比，蹄蝠的耳蝸?zhàn)畲?，其次是菊頭蝠，犬吻蝠耳蝸?zhàn)钚?，但耳蝸均?.5回的螺旋狀。蹄蝠耳蝸溝回即最基底部的外毛細(xì)胞(OHC)排列成三排，第二排和第三排間距較近，排列緊密，第一排與第二排間距相對較寬。三排OHC聽黃斑的最敏銳調(diào)諧頻率分別為菊頭蝠83～86 kHz；蹄蝠60～62 kHz；犬吻蝠20～28 kHz的靜纖毛束呈“V”字型，開角較大，纖毛很短約0.8 μm。內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)表皮板大而相互分離，靜纖毛根數(shù)少而纖毛較長(圖3)。第一排OHC和IHC間距較大(圖3a)，SI區(qū)的三排OHC排列與溝回相似，靜纖毛依然很短；而IHC的表皮板更相互分離而獨(dú)立，但纖毛根數(shù)增加，長度減少，排列較直。第一排OHC和IHC間距較小(圖3b)。CF2區(qū)的三排OHC間距縮小，排列緊密，靜纖毛束“V”字型開角變小，靜纖毛仍然很短；IHC的靜纖毛明顯增多，長度較OHC的要長，排列成眉形(圖3c)。耳蝸頂回的三排OHC排列松散，靜纖毛較長，“V”字型開角較??；IHC的表皮板相互連接，靜纖毛長而根數(shù)最多，緊密排列成排(圖3d)。掃描電鏡觀察中蹄蝠耳蝸毛細(xì)胞體(圖4)，可見頂回的OHC短小而呈球形或短柱狀(圖4a)；SI區(qū)的OHC細(xì)胞體呈細(xì)頸瓶狀，特點(diǎn)是細(xì)胞核上部窄細(xì)，細(xì)胞核部膨大，外被鄧特氏細(xì)胞杯包裹，核下部縮小，整體呈紡錘狀，而并非哺乳動(dòng)物的長柱狀形態(tài)(圖4b)；CF2區(qū)OHC亦呈現(xiàn)和SI區(qū)相似的形狀(圖4c)，但不如SI區(qū)的顯著，基底溝回的OHC細(xì)胞體更小，呈短球狀(圖4d)。

圖1 蝙蝠耳蝸電鏡觀察示意圖[15,17]

掃描電鏡下觀察的蝙蝠耳蝸SI、CF2和溝回部位(a)；蝙蝠耳蝸鏡下基底膜各部位的觀察示意圖(b)；蝙蝠耳蝸各部位到基底的距離和范圍示意圖(c)

圖2 三種回聲定位蝙蝠ABR反應(yīng)閾各頻率分布圖

圖3 中蹄蝠耳蝸掃描電鏡觀察

耳蝸溝回、SI區(qū)、CF2區(qū)和頂回的OHC和IHC的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)。第一排OHC和IHC間距較大，OHC表皮板呈細(xì)長的月牙狀(a)；SI區(qū)的第一排OHC和IHC間距較縮小(b)。CF2區(qū)的三排OHC間距和IHC的靜纖毛明顯增多(c)。耳蝸頂回的三排OHC排列(d)

圖4 掃描電鏡觀察中蹄蝠耳蝸毛細(xì)胞胞體

可見頂回的OHC短小而呈球形或短柱狀(a)；SI區(qū)的OHC細(xì)胞體呈細(xì)頸瓶狀，特點(diǎn)是細(xì)胞核上部窄細(xì)，細(xì)胞核部膨大，外被鄧特氏細(xì)胞杯包裹，核下部縮小，整體呈紡錘狀，而并非哺乳動(dòng)物的長柱狀形態(tài)(b)；CF2區(qū)OHC亦呈現(xiàn)和SI區(qū)相似的形狀(c)，但不如SI區(qū)的顯著?；诇匣氐腛HC細(xì)胞體更小，呈短球狀(d)

2.2.2大蹄蝠耳蝸聽黃斑區(qū)毛細(xì)胞特征 本研究觀察的所有蝙蝠中，大蹄蝠的體型最大，耳蝸亦最大。耳蝸聽黃斑的SI區(qū)和CF2區(qū)的OHC呈最典型的紡錘狀(圖5a、b)，尤其是CF2區(qū)的OHC細(xì)胞體的紡錘狀更顯著，IHC的靜纖毛較長(圖5c)。

大蹄蝠CF2區(qū)的內(nèi)外毛細(xì)胞高分辨掃描電鏡下超微結(jié)構(gòu)可見CF2區(qū)的三排OHC和一排IHC(圖6)，IHC的靜纖毛較OHC的明顯長(圖6a)，IHC的靜纖毛排列成兩排，纖毛長而根部非常細(xì)，而上部較粗，頂端更粗，外排纖毛有數(shù)根斷掉(圖6b)；OHC表皮板呈細(xì)長的“V”型，三排OHC靜纖毛長度相仿，纖毛短而排列成十分整齊的三行，由內(nèi)向外梯度升高，三行靜纖毛相互密切靠攏，由其頂連接和側(cè)連接相互連接在一起(圖6c、d)。

2.2.3菊頭蝠耳蝸聽黃斑區(qū)毛細(xì)胞形態(tài)觀察 與蹄蝠耳蝸相比，菊頭蝠耳蝸較小。耳蝸SI區(qū)的毛細(xì)胞呈典型的紡錘狀；而CF2區(qū)和基底溝回基本呈短球狀或短柱狀(圖7)。

圖5 大蹄蝠耳蝸聽黃斑的SI區(qū)和CF2區(qū)的OHC

呈最典型的紡錘狀，OHC2～3排的指狀突尤其長(a、b)，尤其是CF2區(qū)的OHC細(xì)胞體的紡錘狀更顯著，IHC的靜纖毛較長(c)

圖6 大蹄蝠耳蝸CF2區(qū)觀察高分辨掃描電鏡

IHC的靜纖毛較OHC的明顯長(a)，IHC的靜纖毛排列成兩排，纖毛長而根部非常細(xì)，而上部較粗，頂端更粗，外排纖毛有數(shù)根斷掉(b)；OHC表皮板呈細(xì)長的"V"型，三排OHC靜纖毛長度相仿，纖毛短而排列成十分整齊的三行，由內(nèi)向外梯度升高，三行靜纖毛相互密切靠攏，由其頂連接和側(cè)連接相互連接在一起(c、d)

圖7 菊頭蝠耳蝸各區(qū)毛細(xì)胞形態(tài)

SI區(qū)的OHC細(xì)胞體呈典型的紡錘狀；而CF2區(qū)亦呈短球狀、短柱狀。頂部OHC細(xì)胞體呈長柱狀?；撞縊HC排列緊密，細(xì)胞體呈短柱體(a)；耳蝸黃斑區(qū)OHC細(xì)胞體呈典型的紡錘型，靜纖毛較短(b、e)；第二諧振區(qū)OHC細(xì)胞體呈短柱狀(c、f)；耳蝸頂部OHC呈長柱狀(d)

2.2.4犬吻蝠、小鼠和豚鼠耳蝸各區(qū)毛細(xì)胞形態(tài) 與蹄蝠和菊頭蝠耳蝸相比，犬吻蝠的耳蝸更小。犬吻蝠和豚鼠耳蝸掃描電鏡圖見圖8。犬吻蝠耳蝸頂部OHC的電鏡圖見圖9。

回聲定位蝙蝠犬吻蝠耳蝸SI區(qū)與C57小鼠耳蝸相對應(yīng)的部位對比觀察，可見回聲定位蝙蝠的SI區(qū)OHC胞體均呈紡錘狀(圖10a～c)，而C57小鼠耳蝸相對應(yīng)部位的OHC均呈長柱狀或試管狀(圖10d～f)。OHC形態(tài)表現(xiàn)出回聲定位蝙蝠與哺乳動(dòng)物的明顯差異。

圖8 犬吻蝠、豚鼠的耳蝸掃描電鏡圖

可見在與蝙蝠聽黃斑相對應(yīng)位置的OHC結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的哺乳類動(dòng)物形態(tài)，OHC排列分散，三排OHC間距相近，靜纖毛較長(a、b犬吻蝠)；細(xì)胞體形態(tài)亦呈典型哺乳動(dòng)物的長柱狀，三排OHC指狀突平行(c、d豚鼠)

圖9 犬吻蝠頂部OHC電鏡圖

靜纖毛較長，表皮板呈腎型(a)，SI區(qū)靜纖毛較前稍短，表皮板呈腎型(b)，CF2區(qū)OHC靜纖毛短(c)，以上區(qū)域三排OHC的排列較分散；而基底部靜纖毛最短，三排OHC排列緊密，OHC細(xì)胞體呈短柱狀，表皮板呈細(xì)長“V”型(d)

圖10 回聲定位蝙蝠耳蝸SI區(qū)與C57小鼠耳蝸相對應(yīng)的部位對比觀察

可見回聲定位蝙蝠的SI區(qū)OHC胞體均呈紡錘狀(a～c)；而C57小鼠耳蝸相對應(yīng)的部位的OHC均呈長柱狀或試管狀，第三排OHC的指狀突明顯與網(wǎng)狀板連接(d～f)。

2.3透射電鏡觀察耳蝸聽黃斑區(qū)毛細(xì)胞形態(tài) 透射電鏡下可見三種蝙蝠的耳蝸外毛細(xì)胞體均不呈現(xiàn)大多數(shù)哺乳類動(dòng)物耳蝸外毛細(xì)胞的圓柱狀，并且細(xì)胞體較短,OHC的細(xì)胞核在細(xì)胞中顯得尤其大。犬吻蝠外毛細(xì)胞呈典型的燒瓶狀，蹄蝠和菊頭蝠外毛細(xì)胞呈啞鈴狀，即毛細(xì)胞核部與胞體中上部膨大，而毛細(xì)胞上端變細(xì)(圖11)。內(nèi)毛細(xì)胞均呈倒燒瓶狀，內(nèi)外毛細(xì)胞體內(nèi)細(xì)胞器均存在，但數(shù)量不多。外毛細(xì)胞底部與Deiters細(xì)胞相連，但未見到Deiters細(xì)胞杯狀包裹外毛細(xì)胞底部的現(xiàn)象。豚鼠和棕色田鼠耳蝸外毛細(xì)胞基本呈圓柱體樣形態(tài)。

圖11 透射電鏡觀察蝙蝠耳蝸外毛細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

蹄蝠的耳蝸底回外毛細(xì)胞(OHC)呈燈盞形，支持細(xì)胞(Deiter)、靜纖毛(Steria bundle)、支持細(xì)胞(Deiter) 形成的包裹外毛細(xì)胞杯狀連接(Cup-Deiter)(a)；蹄蝠的耳蝸底回三排外毛細(xì)胞(OHC)呈燈盞形，支持細(xì)胞(Deiter)、靜纖毛(Steria bundle)、支持細(xì)胞(Deiter) 形成的包裹外毛細(xì)胞杯狀連接(Cup-Deiter)(b)；犬吻蝠耳蝸底部的OHC呈短燒瓶狀(c)；菊頭蝠的OHC呈紡錘狀(d)；長翼蝠OHC呈紡錘狀(e)；犬吻蝠耳蝸底部的OHC呈長燒瓶狀(f)

3 討論

回聲定位蝙蝠經(jīng)過長期的進(jìn)化，為了敏銳感覺和調(diào)諧分析其叫聲回聲頻率的多普勒頻移(CF2)，耳蝸明顯出現(xiàn)了有別于非回聲定位蝙蝠和哺乳類動(dòng)物的特化現(xiàn)象，在蝙蝠耳蝸基底膜上代表區(qū)極度擴(kuò)展從而得到極度表達(dá)的區(qū)域稱為"聲黃斑"[1]。根據(jù)大多數(shù)研究者的命名和該區(qū)域主要感覺回聲的生理特點(diǎn)[1,5,10，19～22]，以及與視力的“視黃斑”相對應(yīng)。本文將回聲定位蝙蝠的回聲過度表達(dá)區(qū)稱之為“聽黃斑”，國內(nèi)學(xué)者有的稱之為“聽覺凹”[22,40]。目前研究證明菊頭蝠的聽黃斑最敏感的調(diào)諧頻率是83.0～84.5 kHz[7～9，23]，蹄蝠是60～62 kHz[24],而犬吻蝠的聽黃斑頻率最低是21～27 kHz[4]。本研究三種蝙蝠的聽黃斑反應(yīng)頻率范圍與上述研究結(jié)果基本相同，頻率范圍稍有擴(kuò)大，可能與采用的ABR測試方法不同有關(guān)。

3.1回聲定位蝙蝠聽黃斑的形態(tài)特征 Bruns[11]定量研究蹄蝠屬的馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum)耳蝸形態(tài)學(xué)特化(morphological specialization)與外周聽覺系統(tǒng)的特殊敏銳調(diào)頻的相關(guān)性, 證明該種蝙蝠的耳蝸基底膜平均長度為16.1 mm，明顯比其它體型大小相當(dāng)?shù)牟溉轭悇?dòng)物長，甚至超過其它發(fā)射調(diào)頻聲(frequency modulated, FM)定位的蝙蝠；沿耳蝸管有兩個(gè)顯著的突變中斷結(jié)構(gòu)，對耳蝸的特化功能具有重要意義：第一個(gè)最顯著中斷出現(xiàn)在距基底膜最底端4.3～4.6 mm處，該處基底膜厚度由35 μm突降到10 μm，在稍低處出現(xiàn)急轉(zhuǎn)直下的坡度區(qū)(4.5～4.6 mm)，該區(qū)的基底膜寬度最窄；第二個(gè)中斷出現(xiàn)在基底膜7.8 mm處，此處的基底膜寬度對應(yīng)于骨螺旋板外側(cè)的變化；這些耳蝸特化結(jié)構(gòu)的作用與頻率分析的機(jī)制相互對應(yīng)。Bruns[23]分析馬鐵菊頭蝠的耳蝸結(jié)構(gòu)，正常外毛細(xì)胞核基底部直徑2.85 μm ，頂部3.2 μm，靜息頻率(resting frequency, FR)在82.6～83.3 kHz，回聲出現(xiàn)在83.0～86.0 kHz，在基底膜的4.5 mm處。本研究主要觀察Bruns等研究[10,23]相同位置的基底膜，該處是聽黃斑的主要部位。

Bruns等[3]研究大蹄蝠(greater horseshoe bat)耳蝸發(fā)現(xiàn)其適應(yīng)不同聽覺功能的三個(gè)區(qū)域：①從基底膜1.3～5.4 mm的恒頻(constant frequency)定向片段(圍繞 83 kHz) 的分析區(qū)，該區(qū)域的神經(jīng)結(jié)構(gòu)相似于其他哺乳類動(dòng)物；②5.4～8 mm區(qū)域，頻率從40～80 kHz涵蓋了方向信號(hào)的調(diào)制部分；③從8 mm處到頂部(16 mm) 是頻率低于40 kHz區(qū)域。另外，耳蝸任何部分的外毛細(xì)胞上均無傳出纖維。同年Bruns[25]報(bào)道用掃描電鏡觀察馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumeguinun)的耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞和蓋膜(tectorial membrance，TM)結(jié)構(gòu)，該種蝙蝠聽覺系統(tǒng)的敏銳調(diào)頻在83 kHz 的小頻率帶，是該動(dòng)物的恒頻回聲定位信號(hào)區(qū)；基底膜0～4.5 mm區(qū)是圍繞83 kHz 的頻率響應(yīng)部位，具有以下特征：①與其他哺乳類動(dòng)物相比，OHC的靜纖毛較短；②第一排OHC的Z字形連續(xù)出現(xiàn)在TM相關(guān)的位置上；③第一排OHC與其他兩排間具有寬大的分離帶；④IHC靜纖毛兩倍長于其他哺乳類動(dòng)物及菊頭蝠的其他耳蝸部位；⑤IHC受體表面小且有寬大的分離帶；⑥沒有發(fā)現(xiàn)TM與IHC的接觸結(jié)構(gòu)。這些特征說明它適應(yīng)于提升高頻的敏感性或適應(yīng)特殊的纖細(xì)頻率分析。本研究在菊頭蝠耳蝸SI和CF2區(qū)觀察到OHC同樣具有上述現(xiàn)象，且從ABR反應(yīng)幅度和閾值看，其敏銳高調(diào)頻在83～86 kHz。

Vater等[16]觀察到髯蝙蝠耳蝸外毛細(xì)胞特別短，基底回長12～15 μm ，頂回長28～30 μm ；Deiter細(xì)胞的指突尤其長，其細(xì)胞膜包裹外毛細(xì)胞底部成杯狀，他認(rèn)為外毛細(xì)胞亦呈現(xiàn)典型的哺乳類動(dòng)物耳蝸形狀，并含有電子致密物質(zhì)和微管。明顯的特化表現(xiàn)在蹄蝠耳蝸底回下部的內(nèi)毛細(xì)胞，主要是靜纖毛有兩排纖毛，每排僅有7～8根纖毛，OHC纖毛高度僅為0.8 μm，表皮板小而相互分離[26]，但沒有觀察OHC胞體的形態(tài)差異。Vater等[4]對巴西犬吻蝠(Tadarida brasiliensis) 的耳蝸進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示形態(tài)特征與非特化的高頻過程相關(guān)，如：①基底膜呈輻射狀，而基底膜增厚片段與蓋膜變薄相對等呈齒形匹配；②三排外毛細(xì)胞形態(tài)相似。從基底膜35%～86%處, 頻率在12～30 kHz，該區(qū)域界定為聲黃斑(acoustic fovea)，它包括最大敏感頻率和敏銳調(diào)頻 (21～27 kHz) 的分布，但其頻率低于聲納信號(hào)。聲黃斑具有下列幾個(gè)形態(tài)學(xué)特征：①主要由透明物質(zhì)(hyaline substance)構(gòu)成的基底膜呈連續(xù)輻射狀增厚；②螺旋韌帶(spiral ligament)增加張力纖維層數(shù)目；③三排OHC的靜纖毛排列具有形態(tài)差異。在OHC主動(dòng)運(yùn)動(dòng)表達(dá)差異上，沒有任何超微結(jié)構(gòu)證明OHC細(xì)胞體的組織結(jié)構(gòu)在聽黃斑區(qū)與其它耳蝸區(qū)之間存在定性差異，而僅在OHC的表皮板和靜纖毛束的排列上出現(xiàn)特化。而本研究發(fā)現(xiàn)聽黃斑區(qū)的OHC細(xì)胞體與其他區(qū)域差異甚大，聽黃斑區(qū)的OHC細(xì)胞體呈球形或燒瓶狀、紡錘形，并不是其他區(qū)域的圓柱型，犬吻蝠的最大敏感頻率和敏銳調(diào)頻亦在21～27 kHz范圍。

Reuter等[27]測定昭短尾葉鼻蝠(Carollia perspicillata)的OHC電能動(dòng)性(electromotility)，發(fā)現(xiàn)耳蝸頂部的OHC呈典型的哺乳類動(dòng)物形狀，而基底部的OHC卻相當(dāng)短，呈球形(baii-shaped)，OHC最顯著的位移在細(xì)胞核和表皮板水平上，由低于100 Hz的刺激頻率引出的最大位移約0.3～0.8 μm，與其相同的是本研究現(xiàn)SI和CF2區(qū)的部分OHC呈球形。OHC的形狀增加細(xì)胞膨壓是由于細(xì)胞外液低滲[27]，蹄蝠的OHC呈柱狀[15，16]， 因此，可推測毛細(xì)胞第一個(gè)動(dòng)力是耳蝸回影響浴滲透壓。在蝙蝠中，有多個(gè)結(jié)構(gòu)調(diào)整兩種毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，可能是其對高頻刺激有效放大至關(guān)重要的。魯氏菊頭蝠(Rhinolophus rouxi)非常短的OHC纖毛排顯示夸張的傾斜角相互傾向可能導(dǎo)致剛度增加[15]； 有研究發(fā)現(xiàn)在高頻率增加整個(gè)Corti器勁度有利于機(jī)械相互作用[16]。本研究可見SI和CF2區(qū)的OHC纖毛非常短，并且相互緊密靠攏和連接，亦支持其增加其靜纖毛束剛性的觀點(diǎn)。K?ssl等[18]研究氨基糖苷類損害髯蝠耳蝸毛細(xì)胞后DPOAE變化，用掃描電鏡觀察SI區(qū)和CF2區(qū)的毛細(xì)胞，在編碼第二諧波恒頻回聲定位叫聲組分(second harmonic constant-frequency component of the echolocation call,CF2)和75～100 kHz間的耳蝸區(qū)損害最大，DPOAE幅值升高。這與目前普遍認(rèn)為的耳毒性損害OHC造成DPOAE幅值下降相矛盾[24]。本研究參照他們的方法對蝙蝠聽黃斑區(qū)的毛細(xì)胞進(jìn)行觀察，正常蝙蝠的結(jié)果基本與其觀察的毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)一致，但他們沒有對OHC細(xì)胞體進(jìn)行觀察，本研究對OHC的形態(tài)觀察填補(bǔ)了上述研究的空白。結(jié)合以前的文獻(xiàn)報(bào)道和本研究觀察結(jié)果，基本可以認(rèn)為：①回聲定位蝙蝠耳蝸聽黃斑區(qū)OHC呈燒瓶狀、紡錘狀和啞鈴狀或球狀；②聽黃斑區(qū)的OHC被Diters氏細(xì)胞形成的細(xì)胞杯包裹，不利于OHC的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)；③聽黃斑區(qū)的OHC纖毛特別短，且具有很強(qiáng)的剛性，不利于纖毛束的主動(dòng)擺動(dòng)和振動(dòng)。蝙蝠這三點(diǎn)OHC的特化形態(tài)證明它的聽覺機(jī)制不同于其他哺乳動(dòng)物。

3.2回聲定位蝙蝠聽黃斑區(qū)毛細(xì)胞特化對耳蝸聽覺機(jī)制的影響 目前普遍認(rèn)為哺乳類動(dòng)物耳蝸OHC細(xì)胞體呈長柱狀，以前對回聲定位蝙蝠的研究觀察也證明蹄蝠、髯蝠及犬吻蝠的OHC細(xì)胞體為圓柱狀[15，16]，也有報(bào)告蹄蝠、菊頭蝠和犬吻蝠耳蝸OHC呈燒瓶狀、紡錘狀和和啞鈴狀，明顯有別于其他哺乳類動(dòng)物[18]。僅Reuter[27]觀察到昭短尾葉鼻蝠耳蝸頂部的OHC呈典型的哺乳類形狀，而基底部的OHC卻相當(dāng)短，呈球形(baii-shaped)。我們認(rèn)為決定毛細(xì)胞體形態(tài)的關(guān)鍵是表皮板的形狀，因?yàn)楸砥ぐ迨敲?xì)胞的頂表面形態(tài)特征。普遍認(rèn)為哺乳動(dòng)物的外毛細(xì)胞表皮板基本是圓形，所以O(shè)HC細(xì)胞體的橫截面與其表皮板統(tǒng)一呈圓形，沿其縱軸到圓形細(xì)胞核的底部，OHC細(xì)胞體呈圓柱狀；而回聲定位蝙蝠的OHC表皮板呈細(xì)長的"V"字形，沿其縱軸向下"V"字形逐漸變化為包裹細(xì)胞核圓形呈現(xiàn)為球形。所以，由于觀察回聲定位蝙蝠耳蝸OHC的方向和角度不同，而出現(xiàn)不同的細(xì)胞體形態(tài)。從本研究看垂直于OHC表皮板觀察，其細(xì)胞體呈球形(圖5a、b；圖7b)；而平行于OHC表皮板，沿基底膜的放射方向觀察，OHC細(xì)胞體呈現(xiàn)兩頭大、中間小的啞鈴狀形態(tài)(圖4b、c和d；圖11a和b；圖12)，在某種情況可以呈圓柱狀(圖7c和f)；如果平行于OHC表皮板，沿基底膜的縱向方向觀察，OHC的細(xì)胞體形態(tài)呈頭小而向細(xì)胞核變膨隆的燒瓶狀(圖11c、圖12)。總之，回聲定位蝙蝠耳蝸OHC的細(xì)胞核均呈圓形，因表皮板的特化形態(tài)向細(xì)胞核的縱向變化而呈現(xiàn)不同的形狀(圖12)，與哺乳動(dòng)物的圓形表皮板形成的圓柱狀細(xì)胞體呈鮮明對照。

圖12 回聲定位蝙蝠聽黃斑區(qū)外毛細(xì)胞不同方向觀察形態(tài)模式圖

Wada等[26]觀察豚鼠耳蝸OHC發(fā)現(xiàn)馬達(dá)蛋白(protein motor)在細(xì)胞頂部和基底部無分布，而在細(xì)胞中部細(xì)胞側(cè)膜均勻分布，OHC的運(yùn)動(dòng)主要在細(xì)胞中部。Dallos等(1991)[28]觀察到OHC具有統(tǒng)一直徑的細(xì)長圓柱形，電刺激產(chǎn)生的OHC運(yùn)動(dòng)在細(xì)胞縱向范圍，但不涉及表皮板和細(xì)胞核及突觸區(qū)。Zheng等[29]亦認(rèn)為OHC是具有恒定直徑、長度不同的圓柱體，在豚鼠同樣觀察到OHC細(xì)胞體呈長圓柱形[30～33]，在回聲定位蝙蝠也觀察到OHC細(xì)胞體是圓柱形[4,15]，可能與他們觀察角度不同有關(guān)。回聲定位蝙蝠OHC的這種形態(tài)特化，對其主動(dòng)運(yùn)動(dòng)機(jī)制不利，而對降低基底膜的勁度有利。根據(jù)OHC細(xì)胞體與Deiters細(xì)胞體的密切結(jié)合，以及尤其長的Deiters指狀突與網(wǎng)狀板的結(jié)合這兩個(gè)特點(diǎn)，推測OHC可順應(yīng)TM的諧振，從而促進(jìn)基底膜共振行波的前行傳導(dǎo)，此點(diǎn)尚需以后的研究證實(shí)。

蝙蝠這種在CF2頻率范圍內(nèi)非常狹窄的頻率調(diào)諧的共同特點(diǎn)是：①耳蝸外毛細(xì)胞在SI區(qū)沒有像一般理論認(rèn)為的通過OHC的電能動(dòng)性完成耳蝸的放大作用。所有對蝙蝠的研究均未證明OHC對SI區(qū)和CF2頻率共振器發(fā)揮主要作用；研究證明蝙蝠的OHC起阻尼作用，可改變基底膜的阻抗?fàn)顟B(tài)；②與傳統(tǒng)的耳蝸聽覺機(jī)制認(rèn)為的行波逆向傳播造成耳聲發(fā)射相反，蝙蝠的SI區(qū)的TM和BM共振器與OHC結(jié)合，泵發(fā)功能進(jìn)入鄰近的CF2區(qū)，發(fā)生了標(biāo)準(zhǔn)波的正向傳播，導(dǎo)致耳聲發(fā)射延遲，并且SI區(qū)TM和BM共振器導(dǎo)致耳蝸前庭階和鼓階液體壓力改變。Ren等[34]用掃描激光干涉儀檢測沙土鼠聲反射頻率BM振動(dòng)的縱向形式，發(fā)現(xiàn)耳蝸基底有一個(gè)向前的行波(forward traveling wave),但未發(fā)現(xiàn)反向的逆向行波(backward-traveling wave)出現(xiàn)在聲反射頻率。這些結(jié)果與目前流行理論相矛盾，證明耳聲發(fā)射是通過耳蝸液體的壓縮波，而不是沿BM傳導(dǎo)的反向行波[35]，并且DP產(chǎn)生位點(diǎn)有一個(gè)從基底側(cè)移向頂側(cè)的放大位置[36]， 通過對耳蝸OAE延遲的測量分析，顯示耳蝸內(nèi)總的聲反射延遲相等或略小于向前的延遲(forward delay),說明是耳蝸液體壓力改變導(dǎo)致的壓縮波[37]。耳聲發(fā)射與基底膜振動(dòng)的相位關(guān)系顯示DPOAE從其在耳蝸內(nèi)產(chǎn)生部位到外耳道的傳導(dǎo)方式與傳統(tǒng)的逆向行波不完全相同，DPOAE前行波在耳蝸內(nèi)分布的范圍比按照理論計(jì)算的大得多。 通過測量和比較BM在兩個(gè)點(diǎn)振動(dòng)的相位角發(fā)現(xiàn)，在耳聲發(fā)射頻率上的BM行波向前而不是逆向傳播[34]。實(shí)驗(yàn)證明耳聲發(fā)射是反向傳導(dǎo)的耳蝸液體壓縮波(compression waves)[38]。按照任田英[39]及上述研究[34,37,38]，如果耳聲發(fā)射經(jīng)耳蝸液體壓縮波逆向傳出，那么該機(jī)制在聲音在耳蝸前行傳導(dǎo)中的作用是什么？運(yùn)用蝙蝠聽覺斑的頻率分析現(xiàn)象，可以回答該問題，像蝙蝠耳蝸中前行波是為了對最佳頻率的極大擴(kuò)展和對多普勒頻移回聲(Doppler-shifted echoes)的過度表達(dá)一樣，人類或非回聲定位的哺乳動(dòng)物可能亦存在對最佳頻率臨近的低頻率選擇擴(kuò)展和過度表達(dá)需要，而且，最新的研究表明聽覺凹的范圍與蝙蝠多普勒頻移補(bǔ)償效應(yīng)相關(guān)，即CF蝙蝠可能存在兩大類抑制和興奮型神經(jīng)元通過拮抗性作用調(diào)節(jié)多普勒補(bǔ)償效應(yīng)[40]。對這些聽力學(xué)基本問題的重要推論，尚待大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持和證明?，F(xiàn)有的耳蝸行波理論無法解釋的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加上對特化耳蝸聽覺生理的研究，必將促進(jìn)聽覺新理論的產(chǎn)生和發(fā)展，將對耳蝸機(jī)制和臨床聽力疾病的診斷和治療具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

(本研究在我校環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。電鏡觀察得到213研究所安老師和張芳同志的支持，高分辨掃描電鏡得到西安理工大學(xué)張老師的支持。美國任田英教授閱讀本文并提出修改意見。在此，一并表示感謝！)

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