吳 兵,陳 新,何 超,寇蕓蕓,周 艷
(武漢工業(yè)學院生物與制藥工程學院,湖北武漢430023)
太子參系常用中藥,它為石竹科(Caryophyllaceae)異葉假繁縷屬植物Pseudostellaria Heterophylla(Miq.)Pax的干燥塊根,別名孩兒參、童參。全國各地均有分布,主產于福建、山東、安徽、江蘇等省。具益氣健脾、生浸潤肺之功。用于治療脾虛體倦,食欲不振,神經衰弱和小兒病后體力恢復,為補氣藥中的一味清補之品[1]。與人參功用相仿,但以“清補”見長,特點為益氣但不升提,生津但不助濕,扶正卻不戀邪,補虛又不均猛。主治心悸自汗,疲倦乏力,脾虛食少,氣陰不足,自汗口渴,肺燥干咳等癥。環(huán)肽作為一類重要的化合物,在生物醫(yī)學、藥學等許多方面有著可觀的發(fā)展前景。太子參中的環(huán)肽成分具酪氨酸酶抑制活性[2-4]。國內外對太子參環(huán)肽Pseudostellarin A的研究集中在提取、分離和結構鑒定上[2-4],對太子參中環(huán)肽Pseudostellarin A的含量分析和提取工藝研究尚未見報道。本文以本實驗室分離、純化所得的Pseudostellarin A(純度為98%以上)為對照品,進行太子參Pseudostellarin A的含量測定和分析檢測方法研究,在此基礎上采用正交試驗進行太子參Pseudostellarin A的提取工藝研究,為太子參環(huán)肽的進一步開發(fā),提供實驗依據(jù)。
DIONEX高效液相色譜儀(備有單元泵、自動進樣器以及UVD170U檢測器):美國戴安公司;SB-5200雙頻超聲清洗機:寧波新芝生物科技有限公司;BUCHI旋轉蒸發(fā)儀;瑞士BUCHI公司;GRACE固相萃取儀;予華SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器廠。
Pseudostellarin A對照品(本實驗室分離純化所得,經液相 HPLC檢測,純度 >98%),乙腈(色譜純,科密歐公司),試驗用水為Aquapro超純水,其他試劑為分析純。太子參產于福建,購于武漢市同濟堂藥店。
1.3.1 太子參環(huán)肽提取工藝
提取工藝見圖1。
圖1 太子參環(huán)肽提取工藝流程示意圖
1.3.2 太子參環(huán)肽測定方法
取100 mg太子參環(huán)肽制品定容至100 mL,并從中精密吸取10 mL至10 mL的容量瓶中,HPLC法測定太子參環(huán)肽的含量。
2.1.1 色譜條件
色譜柱為 GRACE C18(250×4.6mm),流動相為乙腈:1‰THF水溶液(25∶75),紫外檢測波長為203nm,柱溫25℃,流速為1mL·min-1,檢測時間為0-15min。
2.1.2 線性關系考察
精密稱取Pseudostellarin A對照品3.1mg,用色譜甲醇定容到10mL的容量瓶中。依次取5mL,2.5 mL,1.25mL,0.625mL,0.3125mL 的對照品溶液用色譜甲醇定容到10mL的容量瓶中,配制出310 μg/mL,155 μg/mL,77.5 μg/mL,38.75 μg/mL,19.375 μg/mL,9.688μg/mL 對照品溶液。根據(jù) Pseudostellarin A的濃度和峰面積繪制標準曲線,以標準品濃度為縱坐標,峰面積為橫坐標,在 9.688 μg/mL—310 μg/mL,Y=0.8676X+0.1729 范圍內峰面積 Y與濃度X的線性關系良好,γ=0.9999(Y=0.8676X+0.1729)。標準曲線見圖2。
圖2 太子參Pseudostellarin A標準曲線
將實驗溫度恒定為30℃,料液比為1∶10,超聲提取時間為1.5h,乙醇濃度為100%,并以此提取條件為實驗的基礎條件。在此基礎實驗條件下,選擇0.5h,1h,1.5h,2h,2.5h 進行單因素實驗,結果見圖3。
圖3 提取時間對環(huán)肽A含量的影響
實驗結果表明,在其他實驗條件不變的情況下,超聲提取時間為1h,1.5 h,2 h時,提取液中環(huán)肽含量較大。環(huán)肽的含量開始隨著提取時間的增長而逐漸增大,但當時間增大到2h時,環(huán)肽含量達到最大,隨后卻開始降低。
在基礎實驗條件下,選定 20%,50%,70%,90%,100%的乙醇溶液進行單因素實驗,實驗結果見圖4。
圖4 乙醇濃度對環(huán)肽A含量的影響
實驗結果表明,在其他條件不變的條件下,在乙醇濃度為70%,90%,100%時,太子參環(huán)肽含量較高。太子參環(huán)肽含量在低濃度的乙醇提取液中含量不是很高,在高濃度的乙醇提取液中含量增加。
在基礎實驗條件下,選定料液‘1∶2,1∶5,1∶7,1∶12,1∶15 進行單因素實驗,實驗結果見圖5。
圖5 料液比對環(huán)肽含量的影響
實驗結果表明,在其他條件不變時,在料液比為1∶7,1∶12時,環(huán)肽A的含量較大。剛開始環(huán)肽A的含量隨著料液比的增加而增加,隨后隨著料液比的增大,環(huán)肽A的含量增加的趨勢開始變得不明顯。環(huán)肽A含量在開始會隨著提取溶劑的增多而增加,而當浸提完全后,再增加溶劑的比例影響不顯著。
在單因素實驗的基礎上選定超聲提取時間、料液比、乙醇濃度三因素為考察指標,按L9(34)正交表三因素三水平實驗,從中篩選最佳的工藝條件和技術參數(shù),結果分別見表1和表2。
表1 正交試驗因素水平表
表2 正交試驗結果
根據(jù)表2可知,影響影響Pseudostellarin A濃度大小的因素顯著性順序依次為C>A>B,即乙醇濃度>超聲時間>料液比。最優(yōu)方案為A2B3C3,即在溫度為30℃,超聲時間1小時,料液比1∶15,乙醇濃度為100%時,太子參Pseudostellarin A的提取濃度最高,測得環(huán)肽A的濃度為4.8μg/g。上述實驗結果見方差分析表3。
表3 方差分析表
正交試驗結果表明乙醇濃度對實驗結果的影響顯著,且影響實驗結果的顯著性依次為乙醇濃度>超聲時間>料液比。優(yōu)化后的提取工藝為A2B3C3,即在溫度為30℃,超聲時間1小時,料液比1∶15,乙醇濃度為100%。在此條件下,太子參環(huán)肽A的提取濃度最大為 4.8 μg/g。
目前國內外尚未報道太子參環(huán)肽Pseudostellarin A的含量測定及分析檢測方法相關的研究,本實驗采用HPLC法,對太子參建立了環(huán)肽Pseudostellarin A的分析檢測方法,在此基礎上通過正交試驗得出在溫度為30℃,超聲時間1h,料液比1∶15,乙醇濃度為100%時,為太子參Pseudostellarin A的提取濃度最高為4.8 μg/g。本實驗研究不僅建立了Pseudostellarin A的含量測定及分析檢測方法,而且進行了太子參環(huán)肽Pseudostellarin A提取工藝研究,為今后Pseudostellarin A進一步的研究奠定了工作基礎。
[1] 李仕海,劉訓紅.江蘇地產太子參中氨基酸及微量元素的分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2001,12(3):199-200.
[2] Hiroshi Morita,Takashi Kayashita,Hideyuki Kobata,et al.Pseudoste-llarins A-C,new tyrosinase inhibitory cyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla[J].Tetrahedron,1994,50(23):6797-6804.
[3] Hiroshi Morita,Takashi Kayashita,Hideyuki Kobata,et al.Pseudostella-rins D-F,new tyrosinase inhibitory cyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla[J].Tetrahedron,1994,50(33):9975-9982.
[4] Hiroshi Morita,Takashi Kayashita,Hideyuki Kobata,et al.Pseudostell-arins A,new tyrosinase inhibitorycyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla[J].Tetrahedron Letters,1994,35(21):3563-3564.