張建林，黃梅香，吳 瓊，梅 輝，王海濱

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023)

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)除提供人體多種氨基酸和能量外，從蛋白質(zhì)原有序列中釋放出的一些小肽還具有多種生理功能，這些小肽不被腸道多種酶系降解可直接被人體吸收［1］。Marta等通過模擬腸消化對(duì)蛋清進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)水解得到的RADHP和YPI這兩種肽對(duì)治療患有高血壓的小白鼠有幫助作用［2］。Maggie等通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蛋清肽有治療腸炎的作用［3］。我國(guó)有世界上最為豐富的禽蛋資源，禽蛋產(chǎn)量1985年以來一直都居世界第一位，2008年約占世界產(chǎn)量的一半［4］。我國(guó)是鴨蛋生產(chǎn)大國(guó)，鴨蛋產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%，但鴨蛋深加工嚴(yán)重滯后［5］。因此對(duì)鴨蛋蛋清進(jìn)行水解，探討其最佳水解條件及水解產(chǎn)物的生理活性，為進(jìn)一步研制鴨蛋蛋清功能肽，促進(jìn)鴨蛋的深加工和開發(fā)高附加值的產(chǎn)品具有重要意義。本文報(bào)道了鴨蛋蛋清肽抗氧化性的研究結(jié)果，為進(jìn)一步的研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鴨蛋：由湖北省仙桃市九珠蛋業(yè)有限公司提供;中性蛋白酶：酶活力為20萬U/g;木瓜蛋白酶：酶活力為80萬U/g，均購自廣西南寧龐博生物工程有限公司。離子交換樹脂201×7(717)、離子交換樹脂001×7(732)購自沈陽市新西試劑廠。

雙氧水(H2O2)，抗壞血酸(Vc)，水楊酸，鐵氰化鉀，氯化鐵，硫酸亞鐵等(均為分析純)。

1.2 儀器

FE20型pH計(jì)(梅特勒-托利多有限公司);DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司);V-1100可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司;80-2離心沉淀器(金壇醫(yī)療儀器廠)。

1.3 試驗(yàn)方法及測(cè)定方法

1.3.1 鴨蛋蛋清肽的制備

將鴨蛋蛋清配成25%(w/w)的溶液，調(diào)節(jié)pH值為9.5、酶底比為8.0%，在50℃條件下用木瓜蛋白酶水解4 h;另一組在 pH值為9.5、酶底比為8.0%、50℃條件下用木瓜蛋白酶水解2 h，然后調(diào)節(jié)水解條件為pH值為9.0、溫度為50℃、酶底比為6.0%，用中性蛋白酶再水解2 h。水解完畢后用沸水浴滅酶活，酶解產(chǎn)物經(jīng)離心后，收集上清液。

1.3.2 脫鹽

上清液分別分兩組處理，一組不經(jīng)脫鹽處理直接冷凍干燥得到蛋清肽;另一組先用陽離子交換樹脂001×7(732)脫鹽，然后用陰離子交換樹脂201×7(717)脫鹽，在10倍柱體積/h的流速下收集流出液，冷凍干燥得到蛋清肽［6］。

1.3.3 抗氧化活性試驗(yàn)

(1)清除羥自由基 (·OH)的測(cè)定［7］

將樣品分別配成不同濃度溶液，各取2 mL，分別加入2mL濃度為6mmol/L的FeSO4，2mL濃度為6mmol/L的H2O2，混合后靜置10min，然后加入2mL濃度為6 mmol/L的水楊酸，混合均勻，靜置30 min后，在510nm處測(cè)量其吸光度，記錄為Ai，用雙蒸水代替水楊酸再次測(cè)量其吸光度，記錄為Aj，空白對(duì)照組以雙蒸水代替蛋白質(zhì)，測(cè)量吸光度，記錄為A0。清除羥自由基計(jì)算公式為：

清除率/%=［A0-(Ai-Aj)］/A0×100

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度;Ai為樣品吸光度;Aj為無水楊酸參加反應(yīng)時(shí)的吸光度。

(2)還原力的測(cè)定

在試管中分別加入樣品1 mL，磷酸鹽緩沖溶液(濃度為 0.2 mmol/L，pH 值為 6.6)2.5 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀2.5 mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸2.5 mL，吸取上清液 2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%的三氯化鐵溶液，在700nm處測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨蛋蛋清肽對(duì)羥自由基 (·OH)的清除作用

鴨蛋蛋清肽和Vc對(duì)羥自由基的清除作用見圖1和圖2。(圖中Ⅰ和Ⅲ是僅用木瓜蛋白酶水解制得的肽，Ⅱ和Ⅳ是用木瓜一中性蛋白酶分步水解制得的肽，Ⅲ和Ⅳ還經(jīng)過了脫鹽處理)

圖1 鴨蛋蛋清肽的羥自由基清除能力

圖2 Vc的羥自由基清除能力

Vc和蛋清肽的羥自由基清除能力大小與其濃度表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，隨著Vc和鴨蛋蛋清肽質(zhì)量濃度的增大，對(duì)羥基自由基的清除能力增強(qiáng)。其中，用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分步水解，且不經(jīng)過脫鹽處理得到的蛋清肽的羥自由基清除能力最強(qiáng)，當(dāng)其濃度為5mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基清除率為24.16%，而Vc濃度為50 μg/mL時(shí)羥自由基清除率為45.29%。蛋清肽與Vc的羥自由基清除能力還有一定差距，這主要是因?yàn)殡牡目寡趸钚耘c肽的分子量大小及組成都有關(guān)系，而通過本實(shí)驗(yàn)得到的蛋清肽未經(jīng)過分離，需要對(duì)其進(jìn)一步研究，分離出具有較高抗氧化性組分并進(jìn)行富集，才能得到清除羥自由基能力更強(qiáng)的肽。

2.2 鴨蛋蛋清肽的還原能力

鴨蛋蛋清肽和Vc的還原能力見圖3和圖4。

Vc和蛋清肽的還原能力與其濃度表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，隨著Vc和蛋清肽質(zhì)量濃度的增大，還原能力增強(qiáng)。其中，用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分步水解，且不經(jīng)過脫鹽處理得到的蛋清肽的還原能力最強(qiáng)，但與Vc相比還有一定差距。

3 結(jié)論

蛋清肽對(duì)羥自由基具有一定清除能力，在還原鐵離子實(shí)驗(yàn)中，也表現(xiàn)出較好還原力，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)鴨蛋蛋清進(jìn)行分步水解，且水解物不進(jìn)行脫鹽處理得到的水解物抗氧化活性最強(qiáng)，其濃度為5mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基清除率為24.16%，

且表現(xiàn)出了一定的還原力。這說明了蛋清肽具有一定抗氧化活性，且隨著濃度的增大表現(xiàn)出的抗氧化活性越強(qiáng)。但需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，分離出抗氧化活性較強(qiáng)的組分并對(duì)其進(jìn)行富集以便做進(jìn)一步的研究。

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［2］ Miguel M，Alonso M J，Salaices M，et al.Antihypertensive ACE-inhibitory and vasodilator properties of an egg white hydrolysate：Effect of a simulated intestinal digestion［J］.Food Chemistry，2007，104(1)：163–168.

［3］ Lee M，Kovacs-Nolan J，Archbold T，et al.Therapeutic potential of hen egg white peptides for the treatment of intestinal inflammation［J］.Journal of Functional Foods，2009，1(2)：161-169.

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