劉艷芳, 唐慶九＊, 楊 焱, 張勁松, 馮 娜, 周 帥

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201106;2.國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201106)

大孔樹脂分離純化發(fā)酵液中蟲草素的研究

劉艷芳1,2, 唐慶九＊1,2, 楊 焱1,2, 張勁松1,2, 馮 娜1,2, 周 帥1,2

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201106;2.國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201106)

采用大孔樹脂富集純化北冬蟲夏草發(fā)酵液中的蟲草素,通過比較發(fā)現(xiàn)6種大孔樹脂中N KA-Ⅱ型大孔樹脂對蟲草素的吸附與解吸效果最好。靜態(tài)和動態(tài)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明,N KA-Ⅱ型樹脂純化蟲草素的最佳吸附平衡時間為6 h,解吸平衡時間為3 h。優(yōu)化后的動態(tài)參數(shù)為:以1 BV/h流速上樣吸附,體積分?jǐn)?shù)10%乙醇除雜,70%乙醇以4 BV/h的流量洗脫。該工藝所得樣品蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)35%,純度提高了10倍,蟲草素回收率達(dá)90%以上,經(jīng)反復(fù)結(jié)晶后得到純度大于98%的蟲草素。

蟲草素;大孔樹脂;純化

蟲草素是一種核苷類抗菌素,具有抗菌、消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫功能等顯著作用[1],現(xiàn)在美國將蟲草素作為治療白血病藥物的研究已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床。北冬蟲夏草是主要產(chǎn)蟲草素的菌株,據(jù)研究表明[2-3],其深層發(fā)酵液中含有大量蟲草素。作者通過優(yōu)化發(fā)酵條件獲得了蟲草素質(zhì)量濃度大于2 g/L的發(fā)酵液,為了更好地對其進(jìn)行利用,需要對發(fā)酵液中蟲草素的分離純化工藝進(jìn)行研究。

目前常用的蟲草素分離純化方法主要有離子交換樹脂吸附法[4-5]、硅膠柱層析[6]以及反相高效液相色譜法[7]等。其中離子交換樹脂吸附法需要用酸堿處理,后處理比較復(fù)雜,其他幾種方法提取得率低,難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此需要尋找更好的蟲草素純化工藝。大孔吸附樹脂是一種有機高分子聚合物,具有吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和等優(yōu)點,因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[8-9]。但是應(yīng)用大孔吸附樹脂分離純化蟲草素卻鮮有報道。因此,作者選用不同型號的大孔吸附樹脂對北冬蟲夏草發(fā)酵液進(jìn)行吸附解吸,從中篩選出適合蟲草素分離純化的樹脂類型,并對其吸附解吸性能進(jìn)行研究,為從發(fā)酵液中規(guī)?；苽湎x草素提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

北冬蟲夏草發(fā)酵液:深層發(fā)酵液過濾除去菌絲體后即得,由作者所在實驗室制備。

1.2 試劑

HPD450和 HPD400型大孔吸附樹脂:滄州寶恩化工有限公司產(chǎn)品;DA-201、N KA-9、S-8和N KA-Ⅱ型大孔吸附樹脂:天津海光化工有限公司產(chǎn)品;Polyp rep 60-10 C18柱填料:Macherey-Nagel公司產(chǎn)品;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)蟲草素(純度≥95%):Sigma公司產(chǎn)品;高效液相用甲醇為色譜級,其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

U ltrospec2100紫外分光光度計:Amersham Biosciences公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀,Waters公司產(chǎn)品;D KY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床,上海杜科自動化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;FA 2004N分析天平,上海宏衡實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗方法

1.4.1 蟲草素含量測定 備測樣品液經(jīng)≤0.45 μm水相濾膜過濾后,高效液相法測定蟲草素含量。色譜條件:色譜柱為C18柱(YMC-Pack ODS AQ,46 mm×300 mm,5μm),流動相為0～30 min內(nèi),以體積分?jǐn)?shù)5%～60%甲醇梯度洗脫,流量1 mL/min,柱溫30 ℃。

1.4.2 樹脂的預(yù)處理 將各樹脂用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡24 h,充分溶脹后,除去上浮的樹脂碎片。用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡洗滌多次,至洗滌液加3倍體積水無白色渾濁出現(xiàn)為止,再用蒸餾水淋洗至無醇味,備用。

1.4.3 不同類型的樹脂對蟲草素吸附和解吸性能的比較 稱取已處理好的 HPD450、HPD400、DA-201、N KA-9、S-8 和 N KA-Ⅱ大孔樹脂各 2 g,加入10 m L發(fā)酵液充分混勻,置于搖床110 r/min振蕩24 h,取上清測定蟲草素含量,計算各樹脂對蟲草素的吸附率;吸附后的樹脂用水洗滌3次后,分別用20 m L體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫,洗脫液經(jīng)高效液相測定蟲草素含量,并計算解吸率。

1.4.4 發(fā)酵液體積對N KA-Ⅱ樹脂吸附蟲草素性能的影響 稱取2 g N KA-Ⅱ樹脂共6份,分別加入5、10、20、30、40、50mL 發(fā)酵液 ,充分混勻 ,置于搖床110 r/min振蕩24 h,取上清液分別測定蟲草素含量,并與發(fā)酵液中蟲草素含量相比,得樹脂對蟲草素的吸附率。

1.4.5 樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定 稱取2 g N KA-Ⅱ樹脂,加入10 m L發(fā)酵液,充分混勻,置于搖床 110 r/min 振蕩 ,分別在 1、2、3、6、9 h 時取樣測定蟲草素含量,與發(fā)酵液中蟲草素含量相比,得不同時間點樹脂對蟲草素的吸附率,對時間作圖,繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.4.6 乙醇體積份數(shù)對N KA-Ⅱ樹脂解吸性能的影響 稱取2 g吸附蟲草素后的N KA-Ⅱ大孔樹脂共5份,分別在其中加入20 m L的體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%和95%的乙醇進(jìn)行解吸,取解吸液測定蟲草素含量,與吸附量相比得不同乙醇濃度對蟲草素的解吸率。

1.4.7 解吸液體積對樹脂解吸性能的影響 稱取2 g吸附蟲草素后的N KA-Ⅱ大孔樹脂共7份,分別加入 1、2、3、4、5、6、8 倍樹脂體積的體積分?jǐn)?shù) 50%乙醇,充分解吸后,測定解吸液中蟲草素含量,與吸附量相比得各解吸液體積所對應(yīng)的解吸率。

1.4.8 樹脂靜態(tài)解吸動力學(xué)特性測定 稱取5 g吸附蟲草素后的N KA-Ⅱ大孔樹脂,加入50 m L體積分?jǐn)?shù)50%乙醇,置于搖床110 r/m in振蕩解析,分別于 10、20、30、40、60、90、120、150、180 min 取樣測定其在259 nm處的吸光度值,對時間作圖,繪制靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線。

1.4.9 樹脂動態(tài)吸附過程中上樣流速對吸附率的影響 分別取處理好的N KA-Ⅱ大孔樹脂各10m L裝柱,將發(fā)酵液分別以1、2、3 BV/h的流速過柱,達(dá)到平衡后,收集流出液,分別測定過柱前后樣品液中蟲草素的含量,計算樹脂吸附率,比較流速對樹脂吸附性能的影響。

1.4.10 動態(tài)解吸過程中洗脫劑流速對解吸率的影響 分別取吸附后的N KA-Ⅱ大孔樹脂各10 m L裝柱 ,將體積分?jǐn)?shù) 50%乙醇分別以 1、2、4、6、10 BV/h的流速進(jìn)行解吸,分段收集流出液,測定其在259 nm處的吸光度值,繪制動態(tài)洗脫曲線。

1.4.11 洗脫所得各部分蟲草素純度比較 在120 g濕樹脂中加入600 m L發(fā)酵液搖床振蕩吸附過夜,清水洗滌樹脂3～4次后裝柱,分別用4倍柱體積的10%、50%、95%乙醇依次洗脫,收集洗脫液濃縮、干燥后稱重,測定其蟲草素含量。

2 結(jié) 果

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗結(jié)果

2.1.1 不同型號的大孔樹脂對蟲草素吸附和解吸性能的比較 由表1可知,不同型號的大孔樹脂對蟲草素的吸附能力差異明顯,其中N KA-Ⅱ型樹脂對蟲草素吸附率最高,達(dá)91.33%,而其他幾種樹脂對蟲草素的吸附較弱,吸附率均在50%以下。比較各大孔樹脂吸附情況,發(fā)現(xiàn)經(jīng)S-8和DA-201樹脂吸附后的流出液顏色明顯變淡,說明兩種樹脂對色素類雜質(zhì)吸附能力較強。從各樹脂解吸率的結(jié)果可知,乙醇對不同樹脂的解吸性能差異明顯,其中對DA-201樹脂的解吸效果最好,達(dá) 97.16%,對N KA-Ⅱ樹脂的解吸率也達(dá)到90%以上,對N KA-9樹脂的解吸性能最差,只有24.85%。綜合考慮樹脂的吸附和解吸性能,選擇N KA-Ⅱ型大孔樹脂來進(jìn)行后續(xù)的條件優(yōu)化。

表1 不同型號的大孔吸附樹脂吸附和解吸能力測定結(jié)果Tab.1 Adsorption and desorption abilities of macroporous resins

2.1.2 發(fā)酵液體積對N KA-Ⅱ樹脂吸附蟲草素性能的影響 由圖1結(jié)果可知,隨著樹脂中樣品液加入體積的增加,樹脂對蟲草素的吸附率逐漸下降。在發(fā)酵液體積為5 m L時,樹脂對蟲草素的吸附率達(dá)99.3%,10 m L時樹脂吸附率為97.46%,當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到20 mL時,樹脂吸附率下降到90%以下?？紤]樹脂吸附率及生產(chǎn)效率,選用2 g樹脂加入10 m L發(fā)酵液進(jìn)行吸附。

圖1 樣品液體積對樹脂吸附率的影響Fig.1 Effects of volume on the adsorption rate of macroporous resin

2.1.3 蟲草素在N KA-Ⅱ樹脂上靜態(tài)吸附解吸條件的優(yōu)化 靜態(tài)吸附時間的比較試驗發(fā)現(xiàn),N KA-Ⅱ樹脂吸附時間達(dá)到3 h后,蟲草素吸附率接近90%,6 h的吸附率超過95%,因此,吸附時間選用6 h可達(dá)到充分吸附的效果。

對解吸附的乙醇體積分?jǐn)?shù)比較發(fā)現(xiàn),乙醇為體積分?jǐn)?shù)50%及以上時,蟲草素從N KA-Ⅱ樹脂上解吸率達(dá)到90%以上,且體積分?jǐn)?shù)50%與70%和95%乙醇解吸率基本接近,高體積分?jǐn)?shù)乙醇易揮發(fā),為節(jié)省成本,選用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇做為洗脫劑進(jìn)行解吸。

當(dāng)解吸液(體積分?jǐn)?shù)50%乙醇)體積達(dá)到樹脂體積的4倍時,蟲草素解吸率達(dá)到90%,而后隨解吸液體積增加無明顯上升趨勢,因此選擇加入4倍樹脂體積的50%乙醇進(jìn)行解吸。

2.1.4 樹脂靜態(tài)解吸動力學(xué)特性 由圖2結(jié)果可知,體積分?jǐn)?shù)50%乙醇加入樹脂中后,40 min內(nèi)解吸效率較高,后期隨著洗脫液中蟲草素含量的增加,溶液中蟲草素濃度達(dá)到相對平衡,解吸速度放緩,到180 min時解吸液吸光度值基本穩(wěn)定,因此,靜態(tài)解吸過程中選擇解吸時間為3 h。

2.2 大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸試驗結(jié)果

2.2.1 上樣流速對樹脂吸附的影響 由圖3結(jié)果可知,隨著上樣流量的增加,樹脂對蟲草素的吸附率逐漸下降。以1 BV/h的流量上樣,樹脂吸附率可達(dá)76%,上樣流量超過2 BV/h后,樹脂吸附率降低到50%以下,因此,選用1 BV/h的流量上樣。

圖2 解吸時間對解吸率的影響Fig.2 Effects of elution time on the desorption rate of macroporous resin

圖3 上樣流量對吸附率的影響Fig.3 Effects of flow rate on the adsorption rate of macroporous resin

2.2.2 洗脫流量對解吸的影響 以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇為洗脫劑,分別以不同的流量進(jìn)行洗脫,其動態(tài)洗脫曲線如圖4所示。由圖中結(jié)果可知,洗脫流量為1～4 BV/h時,洗脫曲線近似,洗脫峰也相對集中,且峰面積差異不大。但洗脫流量達(dá)到6 BV/h以上時,洗脫峰明顯變寬,且拖尾明顯,說明流速過快,不利于對蟲草素的解吸,但流量太低會延長循環(huán)周期,效率降低,因此選擇以4 BV/h的流量進(jìn)行洗脫。

2.3 洗脫所得各部分蟲草素純度測定結(jié)果

從表2結(jié)果可知,體積分?jǐn)?shù)10%乙醇洗脫下來的組分占總量的23.28%,且該組分中蟲草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為8.43%,因此認(rèn)為體積分?jǐn)?shù)10%乙醇洗脫下來的大部分為雜質(zhì),而體積分?jǐn)?shù)50%和95%乙醇洗脫所得的組分中蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近,均為30%以上。因此,可選擇先以體積分?jǐn)?shù)10%乙醇洗脫除去部分雜質(zhì),再以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫,所得樣品蟲草素純度比分離前提高10倍,約為35%,且蟲草素回收率達(dá)90%以上。

圖4 不同流量的動態(tài)洗脫曲線Fig.4 Dynamic desorption curve of different flow rate

表2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫所得組分中蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較Tab.2 Comparison on cordycepin content in fractions eluted by different ethanol percent

經(jīng)大孔樹脂純化后的樣品,按照參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行結(jié)晶,得到粗晶體后,以水反復(fù)重結(jié)晶2～3次得到針狀固體,干燥后得固體粉末,經(jīng)鑒定純度達(dá)98%。

3 結(jié) 語

通過對6種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能的研究,發(fā)現(xiàn)N KA-Ⅱ型大孔樹脂是一種分離蟲草素的理想樹脂,吸附率大且易解吸,較適合北冬蟲夏草發(fā)酵液中蟲草素的純化。N KA-Ⅱ型大孔樹脂是極性樹脂,對極性較強的蟲草素吸附效果較好,這與大孔樹脂的吸附原理是一致的。比表面積對大孔樹脂吸附蟲草素的影響不大,同為極性但比表面積較大的N KA-9樹脂對蟲草素吸附效果不好,這可能與吸附雜質(zhì)較多有關(guān)。

大孔吸附樹脂的吸附動力學(xué)研究對于目標(biāo)產(chǎn)物的純化工藝具有十分重要的意義,在實驗室小試水平考查了靜態(tài)和動態(tài)吸附工藝,發(fā)現(xiàn)樹脂對蟲草素的吸附是一種動態(tài)的緩慢的過程,這與樹脂和樣品液之間的接觸有關(guān),在靜態(tài)吸附過程中對樹脂進(jìn)行攪拌,使樹脂與目標(biāo)化合物充分接觸,并給與充分的吸附時間,提高吸附效率。且動態(tài)吸附的試驗結(jié)果表明,上樣流量與樹脂吸附率成反比,但上樣流量太慢會延長循環(huán)周期,不利于生產(chǎn),因此在實際操作中可選用循環(huán)上樣,以減少目標(biāo)物的損失。另外,大孔吸附樹脂的吸附作用主要是通過表面吸附、表面電性或形成氧鍵等,吸附達(dá)到飽和時,對化學(xué)成分的吸附作用減弱直至消失,此時化學(xué)成分即泄露流出。因此,考查樹脂的吸附容量是十分必要。

在天然產(chǎn)物的分離純化中,成本、安全性和環(huán)保問題也是需要重點考慮的,用大孔樹脂來分離蟲草素,由于樹脂可以反復(fù)使用,成本低,同時使用的溶劑是水和乙醇,因此該工藝比較安全和環(huán)保。

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Studies on Purification of Cordycepin from Fermented Broth by Macroporous Resin

LIU Yan-fang1,2, TANG Qing-jiu＊1,2, YANG Yan1,2, ZHANG Jing-song1,2,FENG Na1,2, ZHOU Shuai1,2

(1.Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai201106,China;2.National Engineering Research Center of Edible Fungi,Shanghai 201106,China)

In this study,macroporous resin was used to extract cordycepin from fermentation bro th of Cordycep smilitaris.By compared with the adsorption and desorption effects of six kinds of macroporous resins to cordycepin,N KA-Ⅱmacroporous resin exhibited the excellent characteristics for cordycepin purification. Through optimization of static and dynamic parameters,the time of adsorption and desorption equilibrium of cordcepin by the N KA-II resin was 6h and 3h,respectively.The current velocity of adsorption on the column was 1 BV/h,and the eluting reagent was 70%ethanol with 4BV/h eluting rate after eliminating the impurity by 10%ethanol.By combination of those optimum conditions,the content of cordycepin,and the recovery rate achieved at 35%and 90%,respectively.Furthermore,the purity of Cordycepin was 98%through recrystallization for several times.

cordycepin,macro resins,purification

＊通信作者：唐慶九(1969-),女,江蘇鹽城人,理學(xué)博士,副研究員,主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)和藥理學(xué)研究。Email:tangqingjiu@saas.sh.cn

TQ 92

A

1673-1689(2011)04-0627-05

2010-08-11

上海市農(nóng)委重點攻關(guān)項目(滬農(nóng)科攻字(2009)第2-2號)。

劉艷芳(1980-),女,山東曲阜人,理學(xué)碩士,助理研究員,主要從事生物化學(xué)與天然產(chǎn)物研究。Email:aliu-1980@163.com