盧孔旭

（浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310032）

牛蒡子為菊科草本植物牛蒡（Arctium lappl L.）的干燥成熟種子，是我國廣泛運用的傳統(tǒng)中藥［1］。藥理學等多項研究表明，牛蒡子中的主要活性成分是牛蒡子苷和牛蒡子苷元［2-5］。然而，牛蒡子中牛蒡子苷的含量只有3％～5％。牛蒡子苷元在牛蒡子中的含量更少，平均含量約為0.19％［6］。由于牛蒡子苷和苷元極性很大，需要用高極性溶劑提?。?］，此外也有些其他方法見文獻報道如采用超臨界流體［8］和超聲波輔助提取法［9］提取。溶劑提取以其方便易處理，有利于工業(yè)化應用等優(yōu)點受到天然藥物提取的青睞。本研究選擇牛蒡子為原材料，通過不同極性溶劑的提取率來合理選擇提取和分離溶劑，采用正交實驗方法，確定溶劑對牛蒡子提取的最佳條件，并通過硅膠柱層析分離純化得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元。以期得到合理便捷的提取和純化的方法開發(fā)制備從天然牛蒡子中提取和純化牛蒡子苷和牛蒡子苷元藥物。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

牛蒡子干燥果實購置于杭州胡慶余堂。牛蒡子苷及牛蒡子苷元標準品購置于上海博蘊生物技術(shù)有限公司。柱層析硅膠100～200目，TLC法用硅膠G，購于青島海洋化工。其他試劑如甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、氯仿、二氯甲烷等均為市售分析純。

1.2 主要儀器

安捷倫高效液相色譜1200。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛蒡子苷和牛蒡子苷元標準曲線的制定

1.3.1.1 標準品溶液制備

稱取牛蒡子苷標準品溶解于100mL無菌水中，分別配置成0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mmol/L的牛蒡子苷溶液；稱取牛蒡子苷元標準品溶解于100mL無菌水中，分別配置成0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mmol/L的牛蒡子苷元溶液。

1.3.1.2 色譜條件

色譜柱為Aglient Eclipse XDB-C8（4.6mm×150mm×5μm）。

檢測條件：甲醇∶水=1∶1.1，流速1.0mL/min，檢測波長280nm，進樣量10μL，柱溫30℃。

1.3.1.3 標準曲線的繪制

以標準品溶液濃度（mmol/L）為橫坐標，液相色譜的相應峰面積為縱坐標，按1.3.1.2的色譜條件進樣。根據(jù)HPLC方法測定結(jié)果繪制標準曲線。回歸得到：牛蒡子苷的標準曲線為Y=83.616X+17.785，R2=0.99983，牛蒡子苷元標準曲線為Y=24.776X+13.241，R2=0.99987。在一定的濃度范圍內(nèi)其線性相關(guān)性較好。

1.3.2 牛蒡子苷及牛蒡子苷元的提取

1.3.2.1 提取溶劑的選擇

稱取10g牛蒡子粉末，石油醚脫脂后，分別用80mL的乙醚，丙酮，80％乙醇和甲醇進行回流提取，提取3次，每次1h。合并3次的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，刮下燒瓶里的浸膏進行稱量。將得到的浸膏烘干后，分別稱取0.1g，用100mL甲醇定容，制成1mg/mL的待測溶液。按1.3.1.2的HPLC條件，分別對乙醚、丙酮、乙醇、甲醇提取物進行檢測。

1.3.2.2 提取工藝條件的優(yōu)化

以乙醇濃度，回流時間，回流次數(shù)和乙醇用量作為考察因素，每個因素選取3個水平，以牛蒡子苷提取率為考察指標，做正交試驗，見表1。

表1 正交因素水平選擇表

1.3.2.3 牛蒡子的粗提

稱取100g的牛蒡子粉末，用80％的乙醇回流，回流時間為1h，每次8倍劑量乙醇，回流3次，合并醇提液后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，得到的浸膏用二氯甲烷萃取1h，萃取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后得到牛蒡子的粗提物。

1.3.2.4 硅膠柱層析

將牛蒡子粗提物溶于一定量的二氯甲烷后，濕法上樣，用二氯甲烷：甲醇（20∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇（4∶4∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯（5∶4，v/v）梯度洗脫。用HPLC測定牛蒡子苷和牛蒡子苷元的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

分別采用乙醚、丙酮和80％乙醇及甲醇作為提取溶劑得到浸膏的量以及通過HPLC檢測得到的牛蒡子苷和牛蒡子苷元的含量結(jié)果如表2所示。

表2 不同提取溶劑檢測結(jié)果 mg

對比分析以上的結(jié)果可以看出，乙醇和甲醇提取的出膏率比較高，而且乙醇和甲醇溶劑更有利于牛蒡子苷和牛蒡子苷元的提取。甲醇溶劑的提取能力和乙醇近似，但由于考慮到甲醇的毒性較大，所以最后選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2 提取工藝條件的優(yōu)化

以牛蒡子苷提取率為考察指標，采用L9（43）正交實驗對牛蒡子苷的提取工藝條件進行優(yōu)化，實驗結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗及結(jié)果分析

從表3中可以看出，4個因素中，回流次數(shù)對醇提工藝影響最大，其次是回流時間，乙醇濃度再次之。由分析可知，乙醇濃度為80％，回流時間為1h，提取次數(shù)為3次，乙醇劑量為80mL為最佳提取條件。

2.3 牛蒡子苷和苷元的提純

2.3.1 牛蒡子的粗提

牛蒡子粉末用80％的乙醇回流，回流時間為1h，每次8倍劑量乙醇，回流3次，合并醇提液后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，得到的浸膏用二氯甲烷萃取1h，萃取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后得到牛蒡子的粗提物。

2.3.2 硅膠柱層析提取純化效果

將牛蒡子粗提物溶于一定量的二氯甲烷后，濕法上樣，用二氯甲烷：甲醇（20∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇（4∶4∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯（5∶4，v/v）梯度洗脫。經(jīng)過硅膠層析純化后的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元的白色粉末，經(jīng)HPLC檢測，牛蒡子苷和牛蒡子苷元的純度。結(jié)果表明其中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的純度分別達到95.5％和94％。這說明了采用硅膠層析方法可以對牛蒡子中的苷和苷元進行有效的分離純化。

3 結(jié)論

由于牛蒡子苷和苷元極性很大，需要用高極性溶劑提取。采用乙醇回流提取牛蒡子的方法簡單方便，能最大程度的提取出牛蒡子中的苷和苷元。硅膠柱層析對于牛蒡子苷和牛蒡子苷元的初提物的提取分離效果較好，適合用于牛蒡子苷和牛蒡子苷元的提取和純化。

［1］曾元兒.中國藥典2010年版（一部）化學成分分析簡明手冊［M］.廣州：中山大學出版社，2010：331.

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