劉馨蓮 殷 舞 李淑蓉 孫 靜

喉癌(laryngeal carcinoma)是頭頸部常見的惡性腫瘤，在我國(guó)該病約占全身腫瘤的1%～5%，列居9～16位，且近年來(lái)喉癌的發(fā)病率有著明顯上升的趨勢(shì)[1]。目前喉癌的病因仍不十分明確，可能與吸煙、飲酒、環(huán)境污染、病毒感染等因素有關(guān)。隨著對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控認(rèn)識(shí)的不斷深入，出現(xiàn)了“癌癥可能是一類細(xì)胞周期性疾病(cell disease)”的觀點(diǎn)。細(xì)胞分子生物學(xué)研究認(rèn)為，腫瘤的本質(zhì)在于細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，細(xì)胞呈現(xiàn)失控性生長(zhǎng)和凋亡減少[2]。體外研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞周期為10 ～48 h。主要分為4 期：G1期(DNA合成前期成期) 、S期(DNA合成期)、 G2期(DNA合成后期) 和M期(有絲分裂期)。細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)作為細(xì)胞周期的正向調(diào)控因素，其異常表達(dá)是導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受到破壞的主要原因之一，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。本文采用免疫組化法，檢測(cè)Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E 4種蛋白產(chǎn)物在喉癌組織中的表達(dá)情況，旨在探討其與喉癌的發(fā)生、發(fā)展以及與臨床各病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2007年9月～2010年2月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)切除的喉癌組織標(biāo)本67例。其中男性42例，女性25例，年齡33～73歲，平均(53.2±8.7)歲；高分化22例，中分化27例，低分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期24例。另取32例距癌灶邊緣0.5～1.0 cm的癌旁正常組織作為對(duì)照。全部病例均經(jīng)病理檢查確診，且術(shù)前未行化療或放療，均有詳細(xì)的臨床病理資料、手術(shù)記錄。全部標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 試劑

鼠抗人Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin E單克隆抗體購(gòu)自BD Pharmingen公司，S-P試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司，DAB試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 方法

免疫組化染色采用 S-P法。石蠟切片脫蠟水化后，微波抗原修復(fù)，過(guò)氧化酶阻斷劑滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，羊血清工作液封閉，滴加一抗4 ℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加鏈親和素一過(guò)氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

Cyclin A、Cyclin E均以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，Cyclin D1、Cyclin B1以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。任意選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野至少含100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，<10%為陰性，分別計(jì)算陽(yáng)性率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyclin D1在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達(dá)

喉癌組織中Cyclin D1表達(dá)陽(yáng)性率為64.2%(43/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[15.6%(5/32)]，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽(yáng)性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。Cyclin D1高表達(dá)與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(表1) (P<0.05)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1高表達(dá)與患者性別及臨床分期無(wú)關(guān)(表1)。

2.2 Cyclin A在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達(dá)

喉癌組織中Cyclin A表達(dá)陽(yáng)性率為59.7%(40/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[9.4%(3/32)]，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽(yáng)性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。CyclinA高表達(dá)與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(表1) (P<0.05)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CyclinA高表達(dá)與患者性別及臨床分期無(wú)關(guān)(表1)。

2.3 Cyclin B1在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達(dá)

喉癌組織中Cyclin B1表達(dá)陽(yáng)性率為71.6%(48/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[12.5%(4/32)]，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽(yáng)性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。Cyclin B1高表達(dá)與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(表1) (P<0.05)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cyclin B1高表達(dá)與患者性別及臨床分期無(wú)關(guān)(表1)。

2.4 Cyclin E在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達(dá)

喉癌組織中Cyclin E表達(dá)陽(yáng)性率為62.7%(42/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[9.45%(3/32)]，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽(yáng)性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。Cyclin E高表達(dá)與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(表1) (P<0.05)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cyclin E高表達(dá)與患者性別及臨床分期無(wú)關(guān)(表1)。

表1 Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E表達(dá)及與喉癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多步驟、多因子參與的過(guò)程。近年來(lái)，分子腫瘤學(xué)研究表明，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控在惡性腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，細(xì)胞周期的進(jìn)程主要依靠細(xì)胞周期蛋白 (Cyclins)，細(xì)胞周期素依賴激酶( cyclin dependent kinase,CDK )和細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑 (cyclin dependent kinase inhibitor,CKI) 三者的形成、激活及相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中，Cyclins是正向調(diào)控CDK活性的關(guān)鍵蛋白，其有規(guī)律的時(shí)相性表達(dá)是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期正常運(yùn)行的必要條件。Cyclins異常表達(dá)可破壞細(xì)胞周期的調(diào)控平衡，是導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長(zhǎng)、惡性轉(zhuǎn)化的重要因素；反過(guò)來(lái)，Cyclins的表達(dá)狀況也可以反映細(xì)胞周期的正常與否、腫瘤的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)及歸宿。在人類腫瘤細(xì)胞中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)。近年研究表明，細(xì)胞周期蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，對(duì)判斷腫瘤的生物學(xué)特征、預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療有重要的意義。

Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白家族中的重要一員它與相應(yīng)的CDK結(jié)合，形成 Cyclin-CDK復(fù)合物，導(dǎo)致CDK激酶活化，使細(xì)胞分裂由G1期進(jìn)入S期[4]。在細(xì)胞周期中，G1/S期調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)經(jīng)過(guò)傳遞、整合匯集到細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，該點(diǎn)調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[5]。Cyclin D1是G1/S轉(zhuǎn)換的正性調(diào)控因子[6]，當(dāng)Cyclin D1擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)時(shí)，G1/S期縮短，促使細(xì)胞增殖，導(dǎo)致癌變。本研究結(jié)果顯示Cyclin D1在癌旁正常組織中低表達(dá)，在喉癌組織中Cyclin D1高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，說(shuō)明喉癌組織中Cyclin D1的表達(dá)是存在的，并且在喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。

Cyclin A在G1期表達(dá)呈陰性或表達(dá)水平極低，隨S期的進(jìn)展而升高，在G2/M期的表達(dá)達(dá)到高峰。Cyclin A在G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換中均發(fā)揮重要作用[7]，既是G1向S期限速步驟，也促進(jìn)G2期向M期轉(zhuǎn)換。Cyclin A與CDK2 結(jié)合使其活化，活化的CDK2 又磷酸化一系列底物，從而對(duì)DNA 合成與有絲分裂等進(jìn)行調(diào)控。研究表明，Cyclin A 表達(dá)異?？墒辜?xì)胞周期發(fā)生改變，與多種腫瘤的形成、進(jìn)展?fàn)顟B(tài)及預(yù)后等相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，Cyclin A在癌旁正常組織中低表達(dá)，在喉癌組織中Cyclin A高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，提示隨著腫瘤級(jí)別的增加，有越來(lái)越多的細(xì)胞增殖活躍。

Cyclin B1 是控制細(xì)胞進(jìn)入G2/M期的關(guān)鍵因子，它與CDK1 的結(jié)合是M期事件啟動(dòng)和進(jìn)行的必要條件，它最早出現(xiàn)于G1期，主要合成于S/G2期，在G2/M期表達(dá)最高，有絲分裂結(jié)束后迅速被泛素化降解(ubiquitination)[9，10]。Cyclin B1與CDK1結(jié)合后形成CDK1/ Cyclin B1 激酶復(fù)合物，催化一系列底物的磷酸化，從而使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期[11]。Cyclin B1是所有細(xì)胞周期素中惟一一個(gè)隨細(xì)胞周期改變而發(fā)生位置轉(zhuǎn)移的細(xì)胞周期素，在細(xì)胞有絲分裂間期，Cyclin B1分布于細(xì)胞質(zhì)中，但到有絲分裂開始時(shí)，在核膜斷裂之前，快速轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。本研究結(jié)果顯示Cyclin B1在在癌旁正常組織中低表達(dá)，在喉癌組織中Cyclin B1高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，提示Cyclin B1的過(guò)表達(dá)可使進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞百分比增加，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

Cyclin E是1種從釀酒酵母菌中提取出來(lái)核蛋白[12]，細(xì)胞周期分子生物學(xué)研究表明，Cyclin E表達(dá)升高始于G1中期，至G1晚期的G1/ S轉(zhuǎn)換點(diǎn)達(dá)到高峰，而后隨細(xì)胞進(jìn)入S期，Cyclin E開始下降，到G2/ M 期降為零，Cyclin E是細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換的主要限速因素之一。Cyclin E與細(xì)胞周期素依賴激酶2( CDK2) 結(jié)合在細(xì)胞周期G1/S晚期起作用。其過(guò)度表達(dá)能加速G1/S轉(zhuǎn)化，縮短G1期進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞提前進(jìn)入S期，干擾DNA、中心體復(fù)制和分裂，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定并可能出現(xiàn)染色體不均等分裂和非整倍體等核型異常，進(jìn)而引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤生成[13～15]。本研究結(jié)果顯示，Cyclin E在在癌旁正常組織中低表達(dá)，在喉癌組織中Cyclin E高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，說(shuō)明在喉癌組織中存在Cyclin E高表達(dá)，表明處于分裂增生狀態(tài)的Cyclin E表達(dá)增強(qiáng)，激活CDKs，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，無(wú)限增生而導(dǎo)致癌癥發(fā)生。

綜上所述，Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E蛋白表達(dá)在喉癌的不同級(jí)別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面具有差異，為判斷喉癌細(xì)胞的增殖活性提供了依據(jù)，說(shuō)明Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E的表達(dá)喉癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，是判斷喉癌惡性程度的重要參考指標(biāo)，可輔助常規(guī)病理診斷并為判斷預(yù)后提供信息。

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