向 芳 金 霞 殷先利 劉振洋 李 勇

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，每年約有30%以上的患者死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而血道和淋巴道轉(zhuǎn)移是導致治療失敗的最常見原因。研究表明腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移同樣伴隨著新生血管形成。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的細胞因子之一,是特異性的血管內(nèi)皮細胞促有絲分裂劑。研究發(fā)現(xiàn)[1]VEGF及其受體參與了腫瘤新生血管的形成，同時也是腫瘤抗血管治療的靶點。最近的研究表明[2]，多種腫瘤都高表達VEGF，正常組織極少表達，而且腫瘤組織VEGF的表達水平與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。Park研究了神經(jīng)生長因子Netrin-1及其受體UNC5B在新生血管軸突導向過程中的作用[3]，發(fā)現(xiàn)細胞表面受體UNC5B可以引導血管發(fā)育，UNC5B基因缺陷可以誘導血管內(nèi)皮細胞的延伸，從而引起血管分支增加。

我們采用免疫組化的方法檢測UNC5B和VEGF在乳腺癌和乳腺良性病變組織中的表達，分析UNC5B和VEGF表達與乳腺癌臨床病理因素之間的關(guān)系及兩者之間的相關(guān)性；再結(jié)合對患者的隨訪結(jié)果，采用Spearman相關(guān)性分析UNC5B在乳腺癌中的表達及意義，判斷UNC5B對乳腺癌患者生存期的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

43例乳腺癌組織和20例乳腺良性病變組織石蠟標本均來自湖南省腫瘤醫(yī)院2003年6月至2004年6月接受乳腺腫瘤切除的患者，乳腺癌患者平均年齡48.74歲,乳腺良性腫瘤患者平均年齡41.8歲。乳腺癌患者中21例為浸潤性導管癌，22例為浸潤性小葉癌；良性病變中7例纖維囊性乳腺病，6例乳腺腺病，7例纖維腺瘤。乳腺癌分期按2002年出版的《美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)癌癥分期手冊》第6版的病理學TNM分期標準[4]進行確定：Ⅰ期3例，Ⅱa期15例，Ⅱb期10例，Ⅲa期12例，Ⅲc期3例。

1.2 試劑

兔抗人UNC5B單克隆抗體濃縮型、超敏鏈霉素抗生物素-過氧化物酶(Streptavidin-peroxidase SP)免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。兔抗人VEGF多克隆抗體購自福州邁新公司。工作液。PBS緩沖液和檸檬酸修復(fù)液由湖南省腫瘤醫(yī)院病理科配制。

1.3 實驗方法

全部標本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，常規(guī)HE染色。按照S-P免疫組化染色試劑盒說明書所示步驟進行UNC5B及VEGF染色。陰性對照：用已知陽性乳腺癌切片，以兔血清封閉液和同種屬非免疫血清作空白對照，結(jié)果陰性。

1.4 結(jié)果判定

所有結(jié)果均由高年資病理科醫(yī)生單獨閱片。高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100 個腫瘤細胞，共計數(shù)1000 個細胞。陽性判斷采用半定量標準[5]：①按染色強度計分“0”分為無色，“1” 分為淡棕黃色，“2”分為棕黃色，“3”分為紅褐色；②按陽性染色細胞百分率計分：0分為陽性細胞數(shù)≤10%；1 分為陽性細胞數(shù)≤25 %；2 分為陽性細胞數(shù)≤50%；3 分為陽性細胞數(shù)>50%。然后將兩類計分結(jié)果的乘積分為以下等級：0 分為(-)，1 ～ 2 分為(+)，3～4分為(++)，5分以上為(+++)。根據(jù)Mattern的判定標準，表達程度的劃分界限是：陰性為(-)～(+)，陽性為(++)～(+++)。

1.5 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0 Windows統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示；計數(shù)資料采用χ2檢驗；采用Spearman相關(guān)性分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 UNC5B及VEGF在乳腺腫瘤組織中表達的特點

2.1.1 UNC5B在乳腺腫瘤組織中表達的情況 UNC5B主要表達在腫瘤細胞胞質(zhì)、胞膜中，呈棕黃至深棕色，邊界清楚，無明顯背景著色；UNC5B在20例良性乳腺腫瘤組織中均為強陽性表達。而在乳腺癌組織中的表達部分有下降，43例乳腺癌患者中陽性者24例(55.8%)，陰性者19例(44.2%)，惡性腫瘤組織中UNC5B表達明顯低于良性腫瘤組織(χ2=12.653,P=0.0004)(見表1)。

2.1.2 VEGF在乳腺腫瘤組織中表達的情況 VEGF陽性表達主要位于腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃至深棕色,邊界清楚。VEGF在20例乳腺良性組織中陽性率為10.0%(2/20)。VEGF在乳腺癌中的陽性表達率為65.1%(28/43)。VEGF在乳腺癌中的陽性表達率明顯高于乳腺良性病變，兩者之間有顯著差異(χ2=16.625,P=0.0001)(見表1)。

表1 乳腺腫瘤UNC5B及VEGF表達情況(例，%)

2.2 UNC5B及VEGF的表達與乳腺癌臨床病理因素間關(guān)系

UNC5B的表達與患者年齡、腫塊大小、受體情況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目及病理類型無關(guān)(P>0.05)。VEGF的表達與患者年齡、腫塊大小、受體情況、臨床分期及病理類型無關(guān)(P>0.05)；但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF陽性率表達較高，為91.7%；沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF陽性率為37.5%，兩者之間差異具有顯著性(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌UNC5B及VEGF的表達與臨床病理關(guān)系

2.3 UNC5B及VEGF的表達與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

43例乳腺癌患者術(shù)后臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，均未接受術(shù)前放化療。經(jīng)手術(shù)切除后均接受不同程度的放化療及內(nèi)分泌治療，至2009年12月，43例患者均接受了6年以上隨訪。對43位乳腺癌患者的無病生存時間與UNC5B的表達情況進行Spearman分析后發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)(γ=0.307，P=0.045)，見表3。同樣對43位乳腺癌患者的無病生存時間與VEGF的表達情況進行Spearman分析后發(fā)現(xiàn)兩者呈負相關(guān)(γ=-0.456，P=0.002)，見表3。

表3 乳腺癌患者UNC5B及VEGF表達與無病生存期的相關(guān)性(例,%)

2.4 乳腺癌組織中UNC5B及VEGF表達之間的關(guān)系

采用直線相關(guān)分析，UNC5B與VEGF的表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)γ=-0.342，P=0.019,見表4。

表4 乳腺癌中UNC5B及VEGF的表達的相關(guān)性(例)

3 討論

形成新的血管是乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的生物學基礎(chǔ)。UNC5B作為1種神經(jīng)生長因子(Netrin)受體，在引導血管生成上起到關(guān)鍵作用。

法國法蘭西學院Anne Eichmann研究小組日前研究發(fā)現(xiàn)[6]，只有在蛋白受體UNC5B存在時，Netrin -1蛋白才能起到收縮內(nèi)皮突起細胞絲狀偽足的作用。當UNC5B受體遇到1個名為Netrin的分子時，就會發(fā)出信號阻止新生血管生長，使之不能過度延伸。該研究表明，血管內(nèi)皮細胞中的UNC5B作為排斥Netrin蛋白的受體調(diào)控了血管系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)育[7]。國內(nèi)有研究顯示UNC5B基因在HCC(肝細胞癌)組織血管內(nèi)皮細胞及活化后的HUAEC(人臍動脈血管內(nèi)皮細胞)中的表達均明顯下調(diào)，提示UNC5B的表達下調(diào)可能與HCC的血管生成相關(guān)[8]。

破壞UNC5B可以誘導血管分叉，從而導致血管系統(tǒng)的錯誤導航，可以推測其與腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移有一定關(guān)聯(lián)。我們研究發(fā)現(xiàn)UNC5B表達缺失的患者預(yù)后較差，其無病生存期也低于UNC5B陽性的乳腺癌患者，這是否意味著腫瘤血管在生成過程中由于缺乏UNC5B的導航，導致血管過度分叉，最終導致轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)？在本研究中，UNC5B表達與腫塊大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和受體情況無明顯相關(guān)性，與年齡，病理類型也無明顯相關(guān)性。但在隨訪中發(fā)現(xiàn)，UNC5B表達缺失的患者的5年生存期明顯低于UNC5B表達陽性的。這提示UNC5B表達缺失可能與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)。但是由于我們研究的標本數(shù)量較少，UNC5B對患者預(yù)后的影響還有待進一步大樣本的研究。

UNC5B在為數(shù)眾多的腫瘤中表達缺失，相應(yīng)的在這些腫瘤中由UNC5B介導的細胞凋亡通路也失活，從而導致細胞在細胞外脅迫壓力下發(fā)生惡變。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺惡性腫瘤UNC5B的表達與乳腺良性腫瘤有顯著差別(表達缺失率44.18%，P<0.05)。這說明UNC5B基因表達缺失的確與乳腺癌的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。這與Thiebault等[9]的研究是一致的。我們可以推測UNC5B基因可能通過誘導細胞凋亡而對腫瘤生長起到負性調(diào)控作用。

VEGF是目前已知的最重要的促血管內(nèi)皮生長因子之一。VEGF又稱血管內(nèi)皮生長因子，正常情況下，VEGF在人體許多正常組織中表達水平極低，而大多數(shù)惡性腫瘤存在VEGF高表達[10]。

我們在對43例乳腺癌組織和20例乳腺良性病變組織的VEGF表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)VEGF在乳腺良性組織中陽性表達率僅10%，而乳腺癌組織中陽性表達率高達65.12%，兩者之間有顯著差異。說明VEGF過表達與腫瘤的發(fā)生及生長密切相關(guān),目前研究認為腫瘤細胞和血管組成1個高度整合的生態(tài)系統(tǒng)，源于腫瘤細胞或相關(guān)炎性細胞的彌散信號促使內(nèi)皮細胞從休克狀態(tài)變?yōu)榭焖僭鲋碃顟B(tài)[11]。

新生血管形成之后，腫瘤灶局部快速播散，增強腫瘤灶的遠處轉(zhuǎn)移能力[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)VEGF表達陰性的預(yù)后較好，表達陽性預(yù)后較差，這一結(jié)果提示VEGF不僅參與了腫瘤的血管生成，還與腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴散密切相關(guān)。這與國內(nèi)外研究結(jié)果是一致的[13，14]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF表達率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高，統(tǒng)計學分析其差異具有顯著性(P<0.05)。表明VEGF可以促進癌細胞通過血管-淋巴管連接進入淋巴循環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)移，它還能促進基膜降解，有利于癌細胞遷移[15，16]。而乳腺癌組織中VEGF表達與腫塊大小、患者年齡、病理類型及受體情況無關(guān)。這與國內(nèi)外相關(guān)報道的結(jié)果是一致的[17]。

在本研究中我們對乳腺癌組織中的UNC5B及VEGF表達情況進行研究發(fā)現(xiàn):VEGF表達與UNC5B呈負相關(guān)(P<0.05)。這說明：乳腺癌組織中UNC5B表達缺失導致血管異常導航，血管分支增加，從而導致血管密度增加和血管形態(tài)改變；而腫瘤組織中大量新生的血管需要血管內(nèi)皮生長因子的誘導，故VEGF的表達上調(diào)。

因此同時阻斷腫瘤組織中VEGF的表達和提高腫瘤組織中UNC5B的表達將在腫瘤的治療中具有廣闊前景。

[1]Newfeld G,Kesslor O,Herzog Y.The interaction of Neuropilin-1 and Neuropilin-2 with tyrosine-kinase receptors for VEGF〔J〕.Adv Exp Med Biol,2002,515:81.

[2]Brown L F，Berse B，Jackman R W，et al.Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinal tract〔J〕.Hum Pathol，1995，26(1):86.

[3]Park K W,Crouse D,Lee M，et al.The axonal attractant Netrin-1 is an angiogenic factor〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004,101(46):16210.

[4]羅蘭 T.斯基爾 主編.癌癥化療手冊〔M〕.科學出版社,2010:370～371.

[5]Vischioni B,Van der Valk P,Span SW，et al.Nuclear Iocalization of surviving is a positive prognostic factor for Nodal in advcanced non-small-cell lung cancer〔J〕.Annals of Oncology,2004,15(11):1654.

[6]Leung-Hagesteijn C，Spence AM，Stern BD，et al.UNC-5，a transmembrane protein with immunoglobulin and thrombospondin type 1 domains，guides cell and pioneer axon migrations in C.elegans〔J〕.Cell,1992，71(2):289.

[7]Lu X，Le Noble F，Yuan L，et al.The netrin receptor UNC5B mediates guidance events controlling morphogenesis of the vascular system〔J〕.Nature，2004,432(7014):179.

[8]張 樺，吳 帆，陶一明,等.UNC5B基因表達下調(diào)與肝細胞癌血管生成的關(guān)系〔J〕.中華外科雜志，2009，47(20)：1569.

[9]Thiebault K，Mazelin L，Pays L,et al.The Netrin-1 receptors UNC5H are putative tumor suppressors controlling cell death commitment〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):4173.

[10]李 容.血管內(nèi)皮生長因子與腫瘤治療〔J〕.國外醫(yī)學·生理、病理科學與臨床分冊，2002，5(22)：475.

[11]王 鑫，李 克，林 娜，等.人參皂苷Rg3對人肺鱗癌裸鼠移植瘤生長及VEGF bFGF表達的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2010，37(2):359.

[12]Harlozinska A.Progress in molecular mechanisms of tumor or metastasis and angiogenesis〔J〕.Anticancer Res,2005,25(5):3327.

[13]Schoppmann S F，F(xiàn)enzl A，Nagy K，et al.VEGF-C express-ing tumor-associated macrophages in lymph node positive breast cancer:inpact on lymphangiogenesis and survival〔J〕.Surgery,2006,39(6):839.

[14]Li Y S，Kaneko M，Amatya V J,et al.Expression of vascular endothelial growth Factor-C and its receptor in invasive micropapillary carcinoma of the breast〔J〕.Pathol Int,2006,56(5):256.

[15]Shih CH,Ozawa S,Ando N,et al.Vascular endothelial gro-wth factor expression predicts outcome and lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus〔J〕 Clin Cancer Res,2000,6(3):1161.

[16]Karpanen T，Egeblad M，Karkkainen MJ,et al.Vasscular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralym phatic tumor growth 〔J〕.Cancer Res,2001,61(5):1786.

[17]陳 俊，于 亮，段紹斌，等.血管內(nèi)皮生長因子-C mRNA和微血管密度與乳腺癌預(yù)后相關(guān)性關(guān)系的探討〔J〕.臨床基礎(chǔ)研究，2009，12(24)：1928.