謝貞建,顏 軍,何 鋼,茍小軍

(成都大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610106)

0 引 言

測(cè)量不確定度,是指表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性,與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[1],它是對(duì)測(cè)定結(jié)果的不可信程度或?qū)y(cè)定結(jié)果有效性的懷疑程度.不確定度越小,測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量越高,使用價(jià)值越大.由于被測(cè)量的真值難以準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn),因此科學(xué)合理地進(jìn)行測(cè)量結(jié)果不確定度的分析,并將其應(yīng)用于測(cè)定結(jié)果的評(píng)定中,對(duì)于提高檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量,降低誤判風(fēng)險(xiǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義[2].本文依據(jù)《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》(JJF 1135-2005)對(duì)HPLC-RI法測(cè)定胃蛋白酶中糖的不確定度進(jìn)行評(píng)定分析,擬為含量測(cè)定數(shù)據(jù)的分析與測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度的評(píng)判提供一種科學(xué)的依據(jù).

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料.

實(shí)驗(yàn)材料包括:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品(分析純,成都科龍化工試劑廠),胃蛋白酶片(重慶格瑞林藥業(yè)有限公司),復(fù)方胃蛋白酶顆粒(重慶申高生化制藥有限公司),乙腈(色譜純,四川航嘉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器.

實(shí)驗(yàn)儀器包括:L-2000高效液相色譜儀、L-2490示差折光檢測(cè)器(日立公司),T15RT臺(tái)式高速離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司),K Q3200超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司),分析天平(北京賽多利斯天平有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制.

分別精確稱取5 g(精確至0.0001 g),經(jīng)過(guò)95℃±2℃干燥2 h的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品,加適量78%乙腈溶解,轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,用78%乙腈定容至刻度,搖勻,備用.

1.2.2 混標(biāo)配制.

分別取等量配制好的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于容量瓶中,78%乙腈定容至刻度,0.45μm微孔膜過(guò)濾,備用.

1.2.3 樣品溶液的配制.

精確稱量研磨成粉末的樣品0.5 g(精確至0.0001 g),加去離子水10 mL溶解后轉(zhuǎn)移到試管中,于沸水浴中加熱10 min,冷卻后離心(10 000 r/min,10 min),轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,用78%乙腈定容至刻度,0.45μm濾膜過(guò)濾,入樣品瓶中供液相色譜測(cè)定. 1.2.4 色譜條件.

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:色譜柱為Sugar D(4.6 mm× 250 mm,5μm),流動(dòng)相為乙睛+水(78∶22),流速1.0 m L/ min,柱溫30℃,檢測(cè)器池溫度35℃,進(jìn)樣量20μL.

2 測(cè)量不確定度評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型

采用HPLC-RI法測(cè)定胃蛋白酶中糖的不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型為,

式中:X為樣品中被測(cè)組分含量,g/100 g;C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上所得被測(cè)組分溶液濃度,mg/mL;V1為樣品溶液定容體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,g.

2.2 不確定度來(lái)源分析[3-5]

從實(shí)驗(yàn)的測(cè)定過(guò)程和所確定的數(shù)學(xué)模型分析, HPLC-RI法測(cè)定胃蛋白酶中糖含量的不確定度的主要來(lái)源包括:標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、定容體積、樣品稱量、分析儀器、樣品重復(fù)檢測(cè)等.

2.3 不確定度分量的量化

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)不確定度.

因標(biāo)樣中各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,S=0.01%(n= 5),服從正態(tài)分布,則由此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,U1=0.01/5=4.5×10-3(B類),自由度,v1=4.

2.3.2 標(biāo)樣(試樣)溶液峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 U2(U3).

U2(U3)主要由進(jìn)樣定量環(huán)體積、容量瓶和刻度移液管體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度共同引起.

進(jìn)樣定量環(huán)進(jìn)樣體積的不確定度為1%,若按均勻分布的規(guī)律考慮,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度,U21=U31=0.01/3=5.8×10-3(B類),自由度,v21=v31=∞.

容量瓶的制造誤差為,2×10-3,服從正態(tài)分布,則溶液稀釋時(shí)引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,U22=U32= 1.4×10-3(B類)(k=3),自由度,v22=v32= ∞.

刻度移液管的分度值為0.01 mL,若按三角分布的規(guī)律考慮,其置信區(qū)間的半寬度為,α=0.005 mL,k=61/2,則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度,U23=U33=0.005/ 6=2.1×10-3(B類),自由度,v23=v33= ∞.

故,

2.3.3 標(biāo)樣(試樣)質(zhì)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U4(U5).

U4(U5)由天平不確定度和標(biāo)樣(試樣)稱重讀數(shù)重復(fù)性不確定度組成.

由檢定證書(shū)中查得天平不確定度,U99=0.0002 g(k=3),服從正態(tài)分布,則其標(biāo)準(zhǔn)不確定,U41= U51=6.7×10-4(B類),自由度,v41=v51= ∞.

稱重時(shí),重復(fù)稱量10次,得極差為0.0002 g,按極差法計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度,U42=U52=2.1× 10-5(A類),自由度,v42=v52=9.

故,

其中,m1和 m2分別代表標(biāo)樣和試樣的質(zhì)量.

2.3.4 測(cè)量誤差引起的不確定度U6.

同一濃度樣品重復(fù)測(cè)量6次,得其測(cè)量誤差為4.0%,按極差法計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度,U6= 0.04/2.83=1.4×10-2,自由度,v6=5.

2.3.5 重復(fù)性引起的不確定度分量U7.

重復(fù)進(jìn)樣6次,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%,則重復(fù)性引起的不確定度分量,U7=0.016/6×1.3= 8.5×10-3,自由度,v7=5.

2.3.6 儀器不穩(wěn)定、環(huán)境溫度及檢測(cè)器靈敏度等不確定度.

對(duì)于儀器不穩(wěn)定、環(huán)境溫度和檢測(cè)器靈敏度所帶來(lái)的不確定度,可將其納入測(cè)定重復(fù)性的不確定度中.而濕度所帶來(lái)的不確定度,可并入質(zhì)量的不確定度中.

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度,

自由度,

2.5 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

取置信概率,p=95%,按有效自由度,v=15,查 t分布表得,tp=t95=2.13,則擴(kuò)展不確定度,

2.6 各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量所占比例

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量所占比例如表1所示.

表1 各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度所占比例

3 討 論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析得出的擴(kuò)展不確定度為4.1%,表明結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠,證明HPLC-RI法可用于胃蛋白酶中糖的不確定度評(píng)定.

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,在引起胃蛋白酶中糖含量測(cè)定的不確定度中,測(cè)量誤差和重復(fù)性所帶來(lái)的不確定度所占比例較大,說(shuō)明儀器本身的不穩(wěn)定性以及環(huán)境溫度的變化是影響不確定度的主要因素.這可能與示差折光檢測(cè)器的檢測(cè)原理和環(huán)境溫度變化有很大的關(guān)系.首先,示差折光檢測(cè)器對(duì)溫度變化很敏感,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于環(huán)境溫度變化使流動(dòng)相在進(jìn)入檢測(cè)池時(shí)的溫度不一樣,進(jìn)而導(dǎo)致折射率改變,造成基線的噪聲增大和基線漂移.因此,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)控制環(huán)境溫度保持不變,且環(huán)境溫度與檢測(cè)池池體的溫差不應(yīng)超過(guò)10℃.其次,流動(dòng)相組成的任何變化都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有明顯的影響,由于示差折光高效液相色譜法不能使用梯度洗脫,因此,一旦色譜條件選定后,最好將流動(dòng)相按需要預(yù)混合好后再由單泵輸送.同時(shí),系統(tǒng)應(yīng)充分平衡,以減小因基線漂移等帶來(lái)的定量誤差.

總之,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,應(yīng)保證測(cè)量環(huán)境的溫度恒定和系統(tǒng)充分平衡,并通過(guò)增加測(cè)定次數(shù)來(lái)減小測(cè)量結(jié)果的不確定度.

[1]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心.JJF 1135-2005 化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定[S].北京:國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 2005.

[2]王承忠.測(cè)量不確定度的驗(yàn)證方法及其應(yīng)用實(shí)例[J].理化檢驗(yàn)(物理分冊(cè)),2008,44(10):296-298.

[3]鄧自西.氣相色譜法和高效液相色譜法分析中不確定度的評(píng)定[J].色譜,2004,22(5):568.

[4]顏斌,曹軍,陳勇,等.高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的不確定度[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2011,21 (2):40-43.

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