劉莉莉，路福平，劉 浩，周 闖

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

拮抗水霉菌株的篩選及抑菌蛋白的分離純化

劉莉莉，路福平，劉 浩，周 闖

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

水霉病是一種廣泛存在于水體中的真菌性病原菌，無寄主選擇性，目前漁業(yè)生產(chǎn)上主要依賴化學(xué)藥物防治，導(dǎo)致病原菌的抗藥性增強.本研究通過平板對峙培養(yǎng)法，篩選到 5株具有拮抗活性的菌株.通過硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠和離子交換樹脂等方式進(jìn)行分離純化，從Bacillus subtilisstrain TCCC11201發(fā)酵液中分離得到一個對水霉病菌具有抑制活性的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其相對分子質(zhì)量為2×104.菌株TCCC 11201代謝產(chǎn)生的活性蛋白具有防治水霉病的潛在應(yīng)用價值.

水霉；拮抗菌；篩選；抑菌蛋白；分離純化

水霉是一種廣泛存在于水體中的條件致病真菌，對寄主無嚴(yán)格選擇性，如果魚類皮膚受傷則不分種類均可感染[1].水霉病又名膚霉病，一年四季均可發(fā)病，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的傷害[2]，目前主要采用化學(xué)方法防治.由于化學(xué)藥劑的使用量大，容易對水體造成污染而破壞生態(tài)平衡，而且化學(xué)藥劑的頻繁施用也會導(dǎo)致發(fā)生嚴(yán)重的水霉耐藥性，近年來通過生物途徑來防治水霉病受到廣泛重視[3].本研究通過平板對峙培養(yǎng)法，篩選到5株具有拮抗活性的菌株，其中菌株TCCC 11201經(jīng)鑒定，確定其為枯草芽孢桿菌.通過硫酸銨鹽析從Bacillus subtilis strain TCCC11201發(fā)酵液中粗提抑菌蛋白，再用葡聚糖凝膠和離子交換樹脂等方式對其分離純化，得到一個對水霉病原菌具有抑制活性的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測，其相對分子質(zhì)量為2×104，對水霉病的防治具有潛在的應(yīng)用價值.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

水霉病原菌Saprolegnia parasitica、拮抗菌株Bacillus subtilisstrain TCCC11201，由本實驗室提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母浸出物 5，NaCl,10，pH,7.5；共培培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉 20，葡萄糖 5，牛肉膏 3，蛋白胨 10，MgSO4·7H2O,2；發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：可溶性淀粉 15，蛋白胨 15，氯化銨 5，MgSO4·7H2O,5，pH,7.0.

1.1.3 藥品試劑

硫酸銨，天津市化學(xué)試劑一廠；葡聚糖凝膠Sephadex,G-25、DEAE-Sepharose,F.F弱堿性陰離子交換樹脂、Tris-base、過硫酸銨，Solarbio公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，Sanland Chemical 公司；TEMED，Sigma公司；硝酸銀、甲醛，天津市化學(xué)試劑三廠.

1.1.4 實驗儀器

超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TD5A-WS低速臺式離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；蛋白純化儀，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；垂直電泳儀，Baygene Biotech公司；冷凍干燥機，北京若比鄰電子信息技術(shù)有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

篩選時先將供試菌株活化，即將斜面菌株轉(zhuǎn)接至試管LB培養(yǎng)基中37,℃、180,r/min培養(yǎng)12,h，采用瓊脂擴散法，將供試菌株與水霉同時接在共培培養(yǎng)基中.水霉切塊(直徑 5,mm)接于平板中央位置，距離培養(yǎng)皿邊緣 2,cm，沿四周等間距處，放入無菌濾紙片，在濾紙片上滴加 10,μL除菌的供試菌株發(fā)酵液(1×108,mL–1)，28,℃培養(yǎng) 48,h 后觀察抑菌效果，測量抑菌圈半徑.以濾紙片圓點至受抑制的水霉菌落邊緣為抑菌圈半徑[4].

1.2.2 拮抗菌發(fā)酵液的蛋白酶穩(wěn)定性檢測

取2份1,mL發(fā)酵液，分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶，使其質(zhì)量濃度達(dá)到 1,mg/mL，以不經(jīng)蛋白酶處理的發(fā)酵液作為空白對照，37,℃保持 1,h后，100,℃水浴 15,min使蛋白酶失活，采用濾紙片法測量各個樣品的抑菌圈直徑.

1.2.3 抑菌蛋白粗提液的制備

從斜面上取 1環(huán)Bacillus subtilisstrain,TCCC 11201，接入裝有 50,mL的 LB 培養(yǎng)基中，37,℃、180,r/min培養(yǎng)12,h，以5%的接種量轉(zhuǎn)接入100,mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37,℃、180,r/min培養(yǎng)48 h.發(fā)酵液經(jīng)10,000,r/min離心 20,min除去菌體，收集上清液，并將上清液分成 5等份，分別用飽和度為 10%、20%、30%、40%、50%的硫酸銨 4,℃鹽析過夜[5]，之后經(jīng)10,000,r/min離心20,min棄上清液，5個樣品用1,mL純凈水溶解，再次離心棄沉淀，即得抑菌蛋白粗提液.

1.2.4 抑菌蛋白的分離純化

鹽析粗提液用 Sephadex,G-25葡聚糖凝膠脫鹽，以超純水為洗脫劑，流量為 1,mL/min，檢測波長為280,nm，按出峰時間分段收集洗脫液，以水霉病原菌為指示菌進(jìn)行活性跟蹤.將經(jīng)Sephadex,G-25葡聚糖凝膠脫鹽過程中收集到的活性組分凍干濃縮(用真空冷凍干燥機，－50,℃抽真空至壓力小于 30,Pa)，再用1,mL 的 Tris-HCl(pH,8.0、0.02,mol/L)溶解之后，用DEAE-Sepharose F.F弱堿性陰離子交換樹脂進(jìn)一步分離純化該活性組分.以Tris-HCl(pH,8.0)與 0.8,mol/L氯化鈉溶液體積比為 100/0～0/100進(jìn)行梯度洗脫，流量為1,mL/min，以280,nm為檢測波長，按出峰時間分段收集洗脫液，以水霉病原菌為指示菌進(jìn)行活性跟蹤，收集有活性的部位備用[6].

1.2.5 活性峰的SDS-PAGE檢測

參照文獻(xiàn)[7]，采用SDS不連續(xù)垂直板電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，采用銀染法染色.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

通過平板對峙培養(yǎng)法，對供試的110株菌株進(jìn)行活性測試.測試結(jié)果表明，110株供試菌株中的TCCC11201、TCCC11214、TCCC11322、TCCC11324、TCCC11331這5株菌對水霉病原菌具有較強的拮抗活性，抑菌圈半徑測試結(jié)果見表1.由表 1可見，這 5株菌中，TCCC11201的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最好.經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌，因此選擇該菌株進(jìn)行分離純化.

表1 5株拮抗菌株對水霉生長的抑制作用Tab.1 Growth inhibition of five antagonistic bacterial for water mold

2.2 發(fā)酵液的蛋白酶穩(wěn)定性

發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶 K處理后抑菌圈直徑為對照的40%，經(jīng)胰蛋白酶處理后抑菌圈直徑為對照的 48%，這說明抗菌物質(zhì)對蛋白酶 K和胰蛋白酶都比較敏感，證明發(fā)酵液中含有抑菌蛋白.

2.3 發(fā)酵液中抑菌蛋白的粗提

用硫酸銨鹽析法提取發(fā)酵液中的抑菌蛋白，飽和度分別為 10%、20%、30%、40%和 50%的硫酸銨 4,℃鹽析過夜，離心收集抑菌蛋白粗提物，室溫下晾干；然后用超純水溶解至質(zhì)量濃度為 1,g/L，取 50,μL用濾紙片法測試抑菌活性[8]，結(jié)果如圖 1所示.硫酸銨飽和度為50%時的粗提物抑菌活性最強.

圖1 硫酸銨鹽析飽和度的平板檢測Fig.1 Flat detection of ammonium sulfate saturation

2.4 抑菌蛋白的分離純化

菌株 11201的抑菌蛋白粗提液以超純水為洗脫劑經(jīng)葡聚糖凝膠 Sephadex,G-25脫鹽純化時，分別有出峰時間為 12～20,min和 30～34,min的兩個峰，如圖 2所示.以水霉病原菌為指示菌進(jìn)行活性跟蹤，其中出峰時間為 12～20,min的峰具有很強的抑菌活性，因此，將此段峰進(jìn)一步分離純化.

圖2 SephadexG-25脫鹽純化曲線Fig.2 Desalting purification curve of Sephadex G-25

粗提液經(jīng)葡聚糖凝膠 Sephadex,G-25脫鹽純化后，將出峰時間為 12～20,min的活性峰凍干后用Tris-HCl緩沖液溶解，再用DEAE-Sepharose,F.F弱堿性陰離子交換樹脂分離純化，分成4個部分，如圖 3所示.經(jīng)活性跟蹤測試發(fā)現(xiàn)，其中出峰時間為 21～27,min的峰為活性峰，對水霉病原菌具有很強的抑制活性，抑菌活性測試結(jié)果如圖4所示.

圖3 DEAE-Sepharose F.F離子交換樹脂純化曲線圖Fig.3 Purification curve of DEAE-Sepharose F.F ionexchange resin

圖4 純化后各組分對水霉病原菌的抑制活性Fig.4 Inhibition of each constituent to water mold after purification

2.5 活性峰的SDS-PAGE檢測結(jié)果

經(jīng)離子交換凝膠分離純化后，出峰時間為 21～27,min的活性成分峰用 SDS-PAGE檢測.由于銀染的靈敏度很高，電泳檢測時只有一條蛋白條帶，說明粗提液經(jīng)分離純化后抑菌蛋白純度很高.電泳結(jié)果如圖5所示，抑菌蛋白相對分子質(zhì)量約為2×104.

圖5 蛋白電泳檢測圖Fig.5 Detection of the active constituent with protein electrophoresis

3 討 論

水霉病的發(fā)生主要因為緊迫造成的二次性感染，魚會因擁擠、移動或其他不良環(huán)境因素的影響造成體表組織受傷，水中的水霉病游孢子即伺機附著，進(jìn)而貫穿真皮深入肌肉，使皮膚與肌肉壞死崩解.過去人們常用孔雀石綠治療水霉病，而孔雀石綠對人類有致畸、致癌等毒副作用，而且長期使用會造成環(huán)境污染及其他不良后果，2002年孔雀石綠因其潛在的致癌性被列為禁用漁藥[9].目前市場上銷售的防治水霉病的藥物主要有：水霉凈、克霉凈、霉凈和漁瘟康等.這些藥物的大量使用造成了環(huán)境污染的加劇，耐藥菌株越來越多，加上食用安全問題，因此這些藥物被限制使用.現(xiàn)在國際市場對水產(chǎn)品質(zhì)量要求更加嚴(yán)格，養(yǎng)殖魚體內(nèi)抗生素的殘留問題已到了不容忽視的地步，能否借助于生物技術(shù)制備可取代化學(xué)藥物的高效抑菌蛋白，用于水霉病的防治，成為我們關(guān)注的重點和突破的方向.

Hussein等[10]從受水霉病損害的類鮭魚表面分離出一株體外具有抑菌活性的細(xì)菌；Balcázar等[11]發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的拮抗混合物對水霉病原菌有拮抗作用；國內(nèi)也有水霉病拮抗菌篩選及活性物質(zhì)的性質(zhì)研究等方面的報道.枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要有抗生素類和抑菌蛋白類，LIU等[12]從B. subtilis B-916的發(fā)酵液中分離到相對分子質(zhì)量為 4.19×104的蛋白 Bacisubin；李晶等[13]從枯草芽孢桿菌 B29菌株的發(fā)酵液中分離得到相對分子質(zhì)量約為4.23×104的抑菌蛋白B29I；劉靜等[14]從枯草芽孢桿菌JA的發(fā)酵液中分離到相對分子質(zhì)量約為1.0×104的環(huán)狀脂肽；Motta等[15]從枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中分離到一種相對分子質(zhì)量為5.0×104的抗菌肽.本研究從枯草芽孢桿菌菌株TCCC11201的發(fā)酵液中分離出一個相對分子質(zhì)量為2.0×104左右的蛋白，其對水霉病原菌具有很強的抑制活性，其結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步分析鑒定.

［1］黃琪琰. 水產(chǎn)動物疾病學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1996：142-143.

［2］倪達(dá)書. 魚類水霉病的防治研究[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1982：8-10.

［3］張書俊，楊先樂，李聃，等. 水霉拮抗菌的篩選及其拮抗作用的初步研究[J]. 水生生物學(xué)報，2008，32(3)：301-307.

［4］杜連祥，路福平. 微生物學(xué)實驗技術(shù)[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2008：349-354.

［5］賈潔. 枯草芽孢桿菌 R21-4抗菌蛋白的分離提取與應(yīng)用[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，2005.

［6］趙濤. 枯草芽孢桿菌 A3-2菌株的分離鑒定及抗菌蛋白的分離純化與性質(zhì)研究[D]. 山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，2002.

［7］郭堯君. 蛋白電泳實驗技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1992：80-91.

［8］廖文彬，鮑時翔. 紅樹林放線菌產(chǎn)抗菌菌活性物質(zhì)的分離純化研究[J]. 藥物生物技術(shù)，2004，11(6)：376-380.

［9］翟毓秀，郭瑩瑩，耿霞，等. 孔雀石綠的代謝機理及生物毒性研究進(jìn)展[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，37(1)：27-30.

［10］Hussein M M A，Hatai K. Pathogenicity ofSaprolegniaspecies associate with outbreaks of salmonid saprolegniosis in Japan[J]. Fisheries Science，2002，68(5)：1067-1071.

［11］Balcázar J L，Vendrell D，de Blas I，et al. In vitro competitive adhesion and production of antagonistic compounds by lactic acid bacteria against fish pathogens[J].Veterinary Microbiology，2007，122(3/4)：373-380.

［12］LIU Yongfeng，CHEN Zhiyi，Ng T B，et al. Bacisubin，an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities fromBacillussubtilisstrain B-916[J].Peptides，2007，28(3)：553-559.

［13］李晶，楊謙. 生防枯草芽孢桿菌的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(1)：106-111.

［14］劉靜，王軍，姚建銘，等. 枯草芽孢桿菌 JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J]. 微生物學(xué)報，2004，44(4)：511-513.

［15］Motta A S，Lorenzini D M，Brandelli A. Purification and partial characterization of an antimicrobial peptide produced by normalBacillussp. isolated from the Amazon Basin[J]. Current Microbiology，2007，54(4)：282-286.

Selection of Antagonistic Bacteria forSaprolegnia parasiticaand Isolation of Its Antibiotic Protein

LIU Li-li，LU Fu-ping，LIU Hao，ZHOU Chuang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Saprolegnia parasiticais a pathogenic fungal of the fish，which is prevalence without host selectivity. Recently，it was prevented and treated mainly depend on the chemicals. Five bacterial from the strain bank of our laboratory were sieved out with the dural culture method. A kind of protein was separated out from the fermentation broth of theBacillus subtilisstrain TCCC 11201 which can inhibit the growth of water mold through sephadex gel，ion exchange resin and so on.After detected with SDS-PAGE protein electrophoresis，its molecular weight is about 2×104. This protein has potential application for the prevention and treatment of saprolegnia.

Saprolegnia parasitica；antagonistic bacterial；screening；antibiotic protein；separation and purification

Q939.92

A

1672-6510(2011)04-0018-04

2010–12–11；

2010–03–10

國家科技基礎(chǔ)條件平臺項目(2005DKA21204-10)

劉莉莉（1984—），女，山東德州人，碩士研究生；通信作者：劉 浩，教授，liuhao@tust.edu.cn.