翟 騰，王旭波，王 晶，高金寧，翟介明，張全啟＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東萊州261418）

半滑舌鰨雌性特異fosmid克隆的篩選及FISH定位＊

翟 騰1，王旭波1，王 晶1，高金寧1，翟介明2，張全啟1＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東萊州261418）

通過(guò)對(duì)半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid文庫(kù)進(jìn)行有序混合，成功構(gòu)建了兩步－三維PCR篩選體系，為后續(xù)的基因篩選奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)半滑舌鰨W染色體文庫(kù)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并分別在雌、雄魚(yú)基因組DNA中篩選，獲得1對(duì)雌魚(yú)特異性引物。使用該引物對(duì)fosmid文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到1個(gè)雌魚(yú)特異性克隆，并通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)將克隆定位到了W性染色體上，證實(shí)了使用該體系進(jìn)行文庫(kù)篩選的有效性以及雌魚(yú)引物的特異性，建立了半滑舌鰨遺傳性別的分子及細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定方法，為后續(xù)半滑舌鰨基因組及性染色體的研究奠定了基礎(chǔ)。

半滑舌鰨；fosmid文庫(kù)；超級(jí)池；熒光原位雜交

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）屬鰈形目（Pleuronectiformes），舌鰨科（Cynoglossidae），舌鰨屬（Cynoglossus），為近海冷溫底棲性魚(yú)類(lèi)，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、出肉率高等特性深受消費(fèi)者喜愛(ài)［1］，并已實(shí)現(xiàn)工廠化全人工養(yǎng)殖。隨著基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)于半滑舌鰨基因組的相關(guān)研究也逐漸深入，目前已經(jīng)利用各種載體構(gòu)建了半滑舌鰨的全基因組文庫(kù)，如Shao等［2］構(gòu)建了半滑舌鰨的BAC文庫(kù)，孫曉華等［3］構(gòu)建了雌魚(yú)fosmid基因組文庫(kù)并進(jìn)行了序列分析等?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建可以極大方便基因、基因組、染色體組的研究工作。通過(guò)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行有序混合，構(gòu)建文庫(kù)兩步－三維PCR篩選系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)文庫(kù)的準(zhǔn)確高效篩選，對(duì)于物理作圖、圖位克隆、分子標(biāo)記發(fā)掘及染色體定位等工作有重要作用。

半滑舌鰨具有雌、雄個(gè)體差異巨大的特性，雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度比雄性快2～3倍，成熟雌魚(yú)全長(zhǎng)可達(dá)雄魚(yú)的2倍以上，體質(zhì)量可達(dá)雄魚(yú)的10倍［4］。因此，通過(guò)對(duì)半滑舌鰨性別決定和性腺分化等進(jìn)行研究，并開(kāi)展全雌育種，可以極大地提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖效益。目前，關(guān)于半滑舌鰨性別決定的研究也取得一定進(jìn)展，周麗青等通過(guò)染色體分析，查明了半滑舌鰨性別決定為ZW型，雌性個(gè)體有1個(gè)較大的W染色體［5］；鄧思平等［6］對(duì)性腺分化及溫度對(duì)性別決定的影響的研究，陳松林等［7］獲得了雌魚(yú)特異性AFLP分子標(biāo)記，本研究室的Wang等［8］對(duì)其W性染色體進(jìn)行了顯微切割分離并構(gòu)建了W性染色體DNA文庫(kù)。

快速鑒定半滑舌鰨的遺傳性別是進(jìn)行全雌育苗的重要任務(wù)之一，在過(guò)去研究中，通過(guò)染色體顯微切割技術(shù)，已構(gòu)建了半滑舌鰨W性染色體特異文庫(kù)，因此，從已有文庫(kù)序列中篩選獲得雌魚(yú)特異性引物是進(jìn)行雌雄鑒別的1個(gè)可行方法。獲得的雌魚(yú)特異性引物可通過(guò)三維PCR文庫(kù)篩選系統(tǒng)定位到fosmid文庫(kù)中，然后利用染色體熒光原位雜交技術(shù)（Florescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）將文庫(kù)中的雌魚(yú)特異性DNA片段定位到半滑舌鰨的染色體上，從而有效、直觀地驗(yàn)證所得到的雌魚(yú)引物的特異性。

本研究通過(guò)篩選半滑舌鰨W染色體文庫(kù)，獲得雌魚(yú)特異性引物，同時(shí)利用三維PCR篩選系統(tǒng)，在已構(gòu)建的fosmid文庫(kù)中篩選出含有雌性特異片段的陽(yáng)性克隆，并通過(guò)熒光原位雜交將該克隆定位到半滑舌鰨的W染色體上，證實(shí)了文庫(kù)篩選的有效性、證明了所篩選W染色體引物的特異性，同時(shí)為半滑舌鰨遺傳性別的鑒定提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

建庫(kù)用實(shí)驗(yàn)材料為已建成的fosmid文庫(kù)第1～200號(hào)板，共19 200個(gè)單克隆。

熒光原位雜交所需半滑舌鰨雌魚(yú)取自山東近海（36°26′N(xiāo)，121°21′E）。

1.2 試劑

LB液體培養(yǎng)基，氯霉素，甘油，20×SSC，10%硫酸葡聚糖，TWEEN20，RNase A，生物素－切口平移探針標(biāo)記試劑盒，Avidin－Fluorescein，PI。

1.3 方法

1.3.1 超級(jí)池的構(gòu)建及質(zhì)粒的提取 超級(jí)池的構(gòu)建方法具體參照Z(yǔ)hang等［9］的實(shí)施方案。選取fosmid文庫(kù)中的200個(gè)96孔板，以每20個(gè)板為1組構(gòu)建超級(jí)池，一共構(gòu)建10個(gè)超級(jí)池。每個(gè)超級(jí)池含菌1 920個(gè)，全部超級(jí)池共含菌19 200個(gè)。使用常規(guī)堿裂解法提取超級(jí)池及其二級(jí)池的質(zhì)粒DNA，超純水溶解后4℃保存。

1.3.2 半滑舌鰨雌魚(yú)特異性引物的篩選 本研究室已經(jīng)在前期的工作中建立了染色體的顯微切割技術(shù)，并利用切割獲得的半滑舌鰨W染色體的DNA，構(gòu)建了半滑舌鰨W染色體特異文庫(kù)，分析獲得了文庫(kù)部分克隆的序列［8］，從該文庫(kù)中選取240條W染色體序列，使用Primer Premier（version 5.0）軟件設(shè)計(jì)引物，共得到引物210對(duì)，由博尚公司進(jìn)行引物序列合成。使用梯度PCR儀（Bio－Red）確定各對(duì)引物的最適退火溫度，然后分別以半滑舌鰨雌、雄魚(yú)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR篩選，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃30 s，最適退火溫度30 s，72℃30 s，共25個(gè)循環(huán)，以期獲得雌魚(yú)的特異性引物。

1.3.3 雌魚(yú)特異性引物在fosmid文庫(kù)中的定位 以10個(gè)超級(jí)池的fosmid質(zhì)粒為模板，利用篩選出的半滑舌鰨雌魚(yú)特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR篩選，退火溫度、PCR條件均為各引物的最適條件。對(duì)有陽(yáng)性反應(yīng)的超級(jí)池進(jìn)行行池、列池、板池的2次篩選，從而確定該陽(yáng)性克隆所在的位置。

1.3.4 陽(yáng)性克隆的熒光原位雜交 陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒提取步驟同1.3.1，熒光原位雜交具體步驟參考Wang等［8］的方法。

2 結(jié)果

2.1 超級(jí)池的構(gòu)建

構(gòu)建得到10個(gè)超級(jí)池。每個(gè)超級(jí)池下含35個(gè)二級(jí)池，即：8個(gè)行池、7個(gè)列池及20個(gè)板池。整個(gè)文庫(kù)由10個(gè)超級(jí)池和350個(gè)二級(jí)池組成。

2.2 半滑舌鰨雌魚(yú)特異性引物的篩選

210對(duì)引物經(jīng)過(guò)PCR篩選后，得到1對(duì)雌魚(yú)特異性的引物WS01（F：ACCTGTCAACCAGCAAAT；R：ACAGTGAAACAGCAGGGA）。該引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為239bp。將半滑舌鰨雌、雄各10尾分別提取肌肉DNA作為模板，利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，僅在雌魚(yú)中有擴(kuò)增條帶，表明篩選出的引物是半滑舌鰨雌性特異引物，可以用來(lái)鑒別半滑舌鰨的遺傳性別。

圖1 W染色體特異性引物WS01在半滑舌鰨雌、雄個(gè)體中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of the female－specific primer（WS01）t in female（♀）and male（♂）genomic DNA.M：DL2000 ladder

2.3 fosmid陽(yáng)性克隆的篩選

使用半滑舌鰨雌魚(yú)特異性引物對(duì)超級(jí)池進(jìn)行PCR篩選，結(jié)果見(jiàn)圖2A，在10個(gè)超級(jí)池中第三超級(jí)池有陽(yáng)性信號(hào)。對(duì)第三超級(jí)池（041－060號(hào)板）進(jìn)行第2次篩選，結(jié)果見(jiàn)圖2B、C，可見(jiàn)在H行池、列池3－1、列池4－1及第41號(hào)板有陽(yáng)性信號(hào)，而列池3－1與列池4－1的交集為列池1，表示該克隆位于第41號(hào)96孔板的H－1孔中。

圖2 WS01在10個(gè)超級(jí)池中的篩選結(jié)果Fig.2 Superpools’screening result with female－specific primer（WS01）

2.4 陽(yáng)性克隆的熒光原位雜交結(jié)果

將篩選出的含有雌性特異片段的f克隆提取質(zhì)粒并做成探針，經(jīng)C0t－1 DNA封阻后，對(duì)半滑舌鰨雌魚(yú)染色體分裂相進(jìn)行熒光原位雜交，結(jié)果見(jiàn)圖3。在觀察到的所有分裂相中均出現(xiàn)1個(gè)雜交信號(hào)，該信號(hào)位于W染色體的中部（箭頭所示）。

圖3 A041H1克隆在半滑舌鰨雌魚(yú)染色體上的定位Fig.3 FISH localization of female－specific fosmid clone A041H1 on metaphase chromosome of female C.semilaevis

3 討論

基因組研究特別是物理圖譜的構(gòu)建有3個(gè)決定性的環(huán)節(jié)：連鎖圖的精細(xì)度、基因組文庫(kù)的質(zhì)量和文庫(kù)的篩選效率和準(zhǔn)確性［10－11］，其中第3個(gè)因素是制約整個(gè)基因組研究效率的瓶頸，直接影響到后續(xù)研究的進(jìn)展和可靠性［12－14］。文庫(kù)的篩選分為三維PCR篩選法和雜交篩選法。雜交法使用同位素進(jìn)行探針標(biāo)記，敏感度高但受放射性危害和半衰期短等的限制［15］。PCR篩選法操作簡(jiǎn)單，具有快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高，建成超級(jí)池后工作量小等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)選用三維PCR篩選法對(duì)半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid文庫(kù)進(jìn)行篩選。在對(duì)雌魚(yú)特異性引物的文庫(kù)篩選中可以看出，在構(gòu)建超級(jí)池后，只需要2步共45個(gè)PCR反應(yīng)｛10（超級(jí)池?cái)?shù)）＋8（行池?cái)?shù)）＋7（列池?cái)?shù)）＋20（板池?cái)?shù)）＝45個(gè)PCR反應(yīng)｝，即可從19 200個(gè)克隆中準(zhǔn)確找到目的克隆，可見(jiàn)此三維PCR篩選法效率之高。三維PCR篩選不僅可以迅速有效的篩選到大量功能基因用于基因組研究，還可以結(jié)合fosmid質(zhì)粒末端測(cè)序、FISH、染色體步移等技術(shù)構(gòu)建重疊群contigs，并將相關(guān)基因定位到染色體上，同時(shí)還對(duì)物理圖譜的構(gòu)建以及基因在圖譜上的定位有著重要的貢獻(xiàn)。

半滑舌鰨雌魚(yú)特異性引物的獲得對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)展其性別決定機(jī)制研究具有重要意義，同時(shí)，對(duì)開(kāi)展全雌品種培育也具有重要意義。半滑舌鰨的性別為ZW型決定方式［5］，且雌、雄個(gè)體差異非常大，雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度是雄性的2～3倍，成熟雌魚(yú)全長(zhǎng)可達(dá)雄魚(yú)的2倍以上，體質(zhì)量可達(dá)雄魚(yú)的10倍，如此大的兩性差異在其他魚(yú)類(lèi)中少有［4］。目前半滑舌鰨已實(shí)現(xiàn)工廠化全人工養(yǎng)殖。因此如何快速確定及選育半滑舌鰨雌魚(yú)成為大規(guī)模養(yǎng)殖中創(chuàng)造效益的關(guān)鍵，全雌育苗也成為半滑舌鰨養(yǎng)殖中的重大技術(shù)課題。實(shí)現(xiàn)全雌育苗的重要途經(jīng)之一是通過(guò)偽雄（生理上為雄性但遺傳上為雌性）與正常雌魚(yú)交配獲得超雌個(gè)體，然后由超雌個(gè)體培育全雌后代，而偽雄魚(yú)則可通過(guò)人工誘導(dǎo)雌魚(yú)性逆轉(zhuǎn)獲得，因此，如何從雄魚(yú)群體中識(shí)別偽雄魚(yú)個(gè)體，或者說(shuō)如何簡(jiǎn)單地區(qū)別遺傳上的雌魚(yú)和雄魚(yú)，是開(kāi)展全雌育種的關(guān)鍵之一。不難看出，在篩選到半滑舌鰨雌性特異引物后，只需1次PCR反應(yīng)即可方便的鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，可用于篩選半滑舌鰨偽雄魚(yú)，同時(shí)對(duì)于偽雄與雌魚(yú)交配后代的檢驗(yàn)也能起到重要的作用，從而促進(jìn)半滑舌鰨全雌育種的發(fā)展。同時(shí)，通過(guò)對(duì)fosmid文庫(kù)進(jìn)行三維PCR篩選得到的半滑舌鰨W染色體特異性的陽(yáng)性克隆的方法，為半滑舌鰨性染色體基因組研究、性別相關(guān)的基因研究、性染色體的進(jìn)化等提供了重要的方法參考。

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Screening and FISH Locating of a Female－Specific Fosmid Clone of Half－Smooth Tongue Sole

ZHAI Teng1，WANG Xu－Bo1，WANG Jing1，Gao Jin－Ning1，ZHAI Jie－Ming2，ZHANG Quan－Qi1
（1.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Mingbo Aquatic.Com，Laizhou 261418，China）

A 2－step－3D－PCR screening system of the female half－smooth tongue sole fosmid library was successfully constructed by a orderly mixing of the fosmid clones.By priming and screening W－chromosome library of half－smooth tongue sole，one pair of female－specific primers were obtained.Using the female－specific primers，a W－chromosome DNA fragment was located in the fosmid library and assigned to W－chromosome using florescence in situ hybridization（FISH），which proved the exclusivity of the primers and provided a conformation on the efficiency of the 2－step－3D－PCR screening system.The female－specific primers could be of good use in pseudo－male detection of half－smooth tongue sole.This study provides a base for further genetic analysis in this species and will be important for a better understanding of the C.semilaevis W chromosome.

half－smooth tongue sole；fosmid library；super pool；florescence in situ hybridization

Q959.486

A

1672－5174（2011）11－057－04

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA10A404）；山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)資助

2011－04－08；

2011－05－16

翟 騰（1985－），男，碩士生，從事魚(yú)類(lèi)遺傳育種研究。E－mail：cr－sh123＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：qzhang＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象