王婷婷，趙 麗，夏 萱，王 鵬，江曉路

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

2種海洋寡糖對大麥種子萌發(fā)和生理特性的影響＊

王婷婷，趙 麗，夏 萱，王 鵬，江曉路＊＊

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

本研究應用具有不同電荷性的褐藻寡糖（ADO）和殼寡糖（COS）處理大麥種子，探索在相同條件下不同濃度的海洋寡糖對大麥幼苗生長情況及生理特性的影響。生長指標包括苗長、根長、苗重及根重，以及對大麥種子淀粉酶活力和葉綠素含量的影響。試驗結果表明：當ADO和COS處理濃度分別為0.5%和0.025%時，大麥的各項生長指標、種子淀粉酶活力及葉綠素含量均達到最大值，與對照組相比顯著增加（P＜0.05）。2種海洋寡糖均是具有獨特生理活性的分子片段，分子量大小相近，但基于2種寡糖分子結構的不同，造成在對大麥的促生長方面存在差異性，為以后2種海洋寡糖的合理開發(fā)利用提供了參考。

褐藻寡糖；殼寡糖；大麥；幼苗生長；生理特性

海洋寡糖是將來源于海洋生物的多糖經過降解得到的，相對多糖而言，海洋性寡糖不僅溶解性好，而且表現(xiàn)出較強的生理活性［1］。寡糖一般是由3～10個單糖（Monosaccharide）通過糖苷鍵連接而成的化合物，又稱低聚糖［2］。Albersheim［3］首次提出了寡糖素（Oligosaccharins）的概念，認為寡糖作為信號分子具有調控植物生長、發(fā)育、繁殖的功能，參與了植物的生長發(fā)育調控活動。

本研究選擇經褐藻膠裂合酶降解褐藻膠后得到褐藻寡糖（Alginate－derived oligosaccharide ADO）片段，是由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸結合而成的直鏈線性嵌段型高分子聚合物，并以醛酸（－COOH）或醛酸鹽（－COO－）的形式存在。近年來，許多文章先后證實ADO在植物生長調節(jié)和誘導抗病領域都發(fā)揮著重要的作用，而其對于植物來說作為一種重要的信號分子在植物轉導中的作用機制也有待進一步的研究［4－5］。殼寡糖（Chitosan oligosaccharide COS）是由甲殼素（幾丁質）脫乙酰化的產物殼聚糖降解獲得的堿性寡糖，也是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖［6－7］。COS分子上的游離氨基（－NH2）在酸性條件下可以質子化而帶正電（－NH＋3），形成陽離子聚合物。本試驗中所使用的COS水溶性好，易于吸收，分子量小，在促進植物生長、誘導植物抗性及提高產品品質等方面具有重要作用。

ADO對豌豆和高粱種子的淀粉酶活性和根系活力等具有重要影響［8］，能夠促進種子的萌發(fā)，提高幼苗葉綠素的含量。COS對黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長方面也有很大的促進作用［6］，可以促進種子幼苗及根部的生長。但關于2種寡糖在種子萌發(fā)過程和生理特性的綜合性及比較性報導未見。本試驗系統(tǒng)性的研究了在相同條件下，經不同濃度ADO和COS處理后的大麥種子在生長狀況及生理指標各方面的變化趨勢，進而將2種海洋寡糖的促進效果進行綜合性的對比，為進一步科學合理的利用海洋資源以及在農業(yè)生產中的應用提供一定的科學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗中的大麥種子由青島啤酒公司惠贈，經初步測試選取發(fā)芽率較高的大麥種子進行試驗；ADO和COS由中國海洋大學食品科學與工程學院應用微生物實驗室提供，ADO是褐藻膠經Vibrio sp.510－64菌株產生專一性褐藻膠裂合酶酶解制備的寡糖片段；COS是由殼聚糖經酶解后再脫去部分乙?；难苌?，由氨基葡聚糖聚合而成；供試土壤來自中國海洋大學。

1.1.1 ADO聚合度分析 褐藻寡糖的組分分析采用電噴霧電離質譜儀（TSQ LC／MS／MS，F(xiàn)innegan Company）。電噴霧電離質譜（ESI－MS）采用陰離子模式。樣品溶解于MeOH－H2O溶液中（1∶1）（10 pmol·m L－1），并用注射泵以5μL·min－1的速度注入電噴源。質量掃描范圍從100～1 100 Da。毛細管溫度保持在250℃，氮氣用于霧化和解溶劑化氣體。

試驗中使用的褐藻寡糖經質譜分析后，組分如圖1所示。ADO中可檢測到373（［x M－2H＋Na］－）、571、769、9 674個離子碎片（m／z）峰，由［x M－2H＋Na］－＝373，可知M＝176，為褐藻膠不飽和二糖。因此，該寡糖屬于聚合度為2－5的ADO片段，其中以二糖和三糖含量較高，四糖、五糖含量較低。因此可見本研究中使用的ADO是以二糖和三糖為主的ADO混合物，分子量范圍低于1 000。

圖1 測定褐藻寡糖的ESI－MSFig.1 Mass spectrum of ADO by ESI－MS

1.1.2 COS聚合度分析 COS質譜分析采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI－TOF－MS）分析法（Autoflex，Bruker Daltonik，Bremen，德國）。分析器真空度1.33×10－6Pa，離子源加速電壓25 k V，離子延遲提取125 ns，正離子譜測定，氮氣激光（波長337 nm，脈沖寬度3 ns）。

圖2 測定殼寡糖的MALDI－TOF－MSFig.2 Mass spectrum of COS by MALDI－TOF－MS

如圖2所示，所選用的COS聚合度較小，由圖2中［x M＋Na］＋＝345，可知M＝161，是聚合度為2的殼寡糖，m／z328.4為脫1個氨基（－NH2）的殼二糖，m／z505為三糖［3M＋Na］＋，m／z549為［3M＋Na＋COCH3］＋含1個乙酰基，m／z 572為［3M＋2Na＋COCH3］＋，m／z 681為四糖［4M＋Na＋NH2］＋。因此，此寡糖為聚合度2－5的COS片段，其中以聚合度為2和3的寡糖片段為主，四糖含量較低，并含有微量的五糖。COS與ADO分子量大小相近（＜1 000）。因此，在以下試驗中暫不考慮由于分子量大小的不同所引起的促生長差異性。

1.2 種子處理方法

選取籽粒飽滿的大麥種子，用10%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，再用蒸餾水反復沖洗干凈。將處理后的種子分別浸泡在濃度為0、0.2%、0.4%、0.5%、0.6%的ADO溶液和濃度為0、0.0125%、0.025%、0.050%、0.075%的COS溶液中進行24 h催芽，每種不同濃度的寡糖各浸泡大麥種子60粒。播種于準備好的種植槽中，每格平均播種，不超過10粒，每天加適量的水以保證植物生長過程中所需水分。處理后置于24℃培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)，每組處理重復3次。

1.3 測定項目

1.3.1 生長指標測定 分別測定萌發(fā)7 d后各處理組幼苗的苗長和根長、苗重及根重，并在60℃下烘干至恒重，稱取幼苗和根的干質量。

1.3.2 葉綠素含量測定［9－10］烘干后的大麥葉片分別稱取0.05 g用95%乙醇研磨法提取葉綠素，以提取試劑95%乙醇為對照，分別測定葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665和649 nm處的吸光度計算葉綠素濃度，并計算干重的葉綠素含量（mg·g－1），每組處理重復3次。計算公式：

V為提取液總體積（m L）；A為取樣干質量（g）。

1.3.3 淀粉酶活力測定［11］取1 g經寡糖處理萌發(fā)3 d的大麥種子，加入少量石英砂和3 m L蒸餾水，在研缽中研磨，研磨后轉入到離心管中，用7 m L的蒸餾水將剩余殘渣全部轉入到離心管中。室溫下放置提取15～20 min，然后在3 000 r／min轉速下離心10 min。上清液轉移到50 m L容量瓶中，定容到刻度，備用，每組處理重復3次。

本研究中采用先加熱鈍化β淀粉酶，測定α淀粉酶活力，再與非鈍化條件下的總淀粉酶活力（α＋β淀粉酶）進行比較即可計算出β淀粉酶活力。淀粉酶可以將淀粉水解產生還原糖，產生的還原糖又可以使3，5－二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3－氨基－5－硝基水楊酸。

計算公式：

β淀粉酶活力＝（總淀粉酶活力－α淀粉酶活力）OD：α－淀粉酶水解淀粉生成麥芽糖的毫克數(shù)；OD′：α－淀粉酶對照管中麥芽糖的含量；V s：顯色時所用酶液體積（m L）；V t：樣品稀釋液總體積（m L）；FW：樣品質量（g）；t：酶作用時間（min）。

2 結果

2.1 海洋寡糖對大麥生長指標的影響

由表1所示，經不同濃度的COS和ADO處理的大麥種子幼苗生長趨勢均高于對照組，上升幅度隨著寡糖濃度的增加而呈現(xiàn)先增加后遞減的趨勢，各種生長指標包括苗長、根長及質量也有所提高。但不同濃度的COS和ADO對大麥各項生長指標促進程度有所不同，對照組苗長和根長分別為11.01和10.88 cm，在COS處理組中，當COS濃度為0.025%時苗長和根長分別為13.26和16.06 cm，與對照組相比增量達到20.44%和47.61%，促進效果極其顯著（P＜0.01）。據郭衛(wèi)華［5］對黃瓜種子的研究表明：當COS濃度為100 mg／L時對幼苗的苗長和根長表現(xiàn)出抑制作用。在本研究中所使用COS的濃度對大麥最適的作用濃度較前面文獻中報導的COS濃度略高，但隨著COS濃度的繼續(xù)升高，促生長效果逐漸減弱，苗長的下降趨勢最為明顯，當COS達到0.075%時苗長相對于對照組增量僅為3.54%，促進效果不明顯（P＞0.05），當繼續(xù)增加COS濃度將可能會對苗長生長產生一定的抑制作用。表1表明不同濃度的ADO處理的大麥種子幼苗生長趨勢均高于對照組，當ADO濃度為0.5%時苗長和根長分別為14.70和15.50 cm，與對照組相比增加量達33.47%和53.76%，促進效果均達到極其顯著水平（P＜0.01）（見表1）。

表1 2種海洋寡糖對大麥幼苗生長指標的影響Table 1 Effects of two oligosaccharides on the seedling growth indicators of barley

2.2 海洋寡糖對大麥幼苗葉綠素含量的影響

2種不同濃度的海洋寡糖COS和ADO對大麥葉綠素含量的影響如表2所示，經2種寡糖處理的大麥幼苗葉片總葉綠素含量、葉綠素a、葉綠素b含量均比對照有所提高，上升幅度隨寡糖濃度的增加呈現(xiàn)先遞增后減少的趨勢。通過組內比較，當COS濃度為0.025%時，總葉綠素含量、葉綠素a、葉綠素b含量均達到最大值，與對照組相比總葉綠素含量（DW）達到9.35 mg·g－1，增量為36.05%。而當COS濃度達到0.075%時與對照組相比較總葉綠素增量為3.91%，增幅較小，促進效果不明顯（P＞0.01）。在ADO處理組中，其對總葉綠素促進效果較為明顯，當ADO濃度為0.5%時總葉綠素含量（DW）達到10.86 mg·g－1，相對于對照組總葉綠素增量為57.85%。上述結果表明2種海洋寡糖對促進植物葉片的光合作用，提高葉片葉綠素的含量均有影響。2種寡糖進行組間對比發(fā)現(xiàn)：濃度為0.5%的ADO對總葉綠素含量的促進作用較0.025%的COS更為明顯。光合作用與葉綠素a的含量關系較為密切，因此2種寡糖對葉綠素a含量的影響較大，而葉綠素b含量變化幅度相對較?。ㄒ姳?）。

表2 2種海洋寡糖對大麥葉綠素含量的影響Table 2 Effects of two oligosaccharides on the chlorophyll content of barley

2.3 海洋寡糖對大麥淀粉酶活力的影響

由圖3可以看出，不同濃度COS對大麥淀粉酶活力的影響較大，對照組總淀粉酶活力（FW）為14.458 mg·g－1·min－1，當COS濃度為0.025%時α－淀粉酶和β－淀粉酶活力較高，總淀粉酶活力（FW）達到19.580 mg·g－1·min－1，萌發(fā)中的種子β－淀粉酶活力高于α－淀粉酶活力，因此對β－淀粉酶活力的影響較為明顯。隨著COS濃度升高，β－淀粉酶活力呈迅速下降的趨勢，而α－淀粉酶活性也處于停滯增長的狀態(tài)。這表明，COS可誘導大麥種子中淀粉酶的合成，提高種子中營養(yǎng)物質的利用率，從而促進種子萌發(fā)和幼苗生長，與大麥葉片中葉綠素含量變化規(guī)律基本一致。由圖4可以看出，不同濃度ADO對大麥種子的α－淀粉酶和β－淀粉酶活力均有不同程度的影響。經ADO處理的大麥種子，對照組中總淀粉酶活力（FW）為16.560 mg·g－1·min－1，當ADO濃度為0.5%時總淀粉酶活力（FW）為23.735 mg·g－1·min－1達到高峰。這表明ADO可誘導大麥種子中淀粉酶的合成，濃度為0.5%的ADO對大麥淀粉酶酶活力的影響較COS明顯，在促生長方面具有一定的優(yōu)勢。

圖4 褐藻寡糖對大麥淀粉酶活力的影響Fig.4 Effects of ADO on the amylases activity of barley

3 討論

圖3 殼寡糖對大麥淀粉酶活力的影響Fig.3 Effects of COS on the amylases activity of barley

本研究以大麥為材料，研究相同條件下不同濃度的2種海洋寡糖處理的大麥種子在萌發(fā)狀況和酶活力方面的差異以及它們之間的可能聯(lián)系，以期為進一步闡明寡糖在種子萌發(fā)中的作用及其促生長的生理機制提供依據。試驗結果表明，低濃度寡糖處理可以提高大麥種子的苗長和根長，促進種子萌發(fā)，而高濃度寡糖處理對大麥種子的萌發(fā)呈明顯的下降趨勢，甚至會出現(xiàn)抑制作用。一般認為，種子萌動初期，膜保持一定的透性及完整性有利于種子的吸脹及對營養(yǎng)物質的吸收，寡糖大多存在于細胞膜表面，是細胞間或細胞內傳遞生物信息的載體，參與很多生物反應的基本過程［13］。寡糖對植物防御系統(tǒng)的激活作用在高等植物中普遍存在，而且植物和病原菌細胞壁中的其他結構多糖也具有類似的誘抗活性［14］。

種子萌發(fā)和幼苗階段是作物生長的起始階段，也是對外界因子最敏感的時期之一，因此種子幼苗的根長、苗高、單株鮮重和單株干重是評價幼苗生長狀況最為直觀的指標。葉綠素是植物進行光合的色素，葉綠素含量在一定程度上反映了植物光合作用的水平，是衡量植物葉片功能的一個重要指標［15］。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，廣泛存在于動植物和微生物中。β－淀粉酶存在于休眠種子中，而α－淀粉酶是在萌發(fā)過程中誘導產生的，β－淀粉酶含量高于α－淀粉酶，隨著種子萌發(fā)，α－淀粉酶的量不斷增加［8］。

許多報道證明ADO和COS對植物的生長均具有促進作用［16］。郭衛(wèi)華等［5］應用不同濃度的COS處理黃瓜種子和幼苗，得出COS在低濃度時能夠促進黃瓜種子發(fā)芽，對黃瓜幼苗生長有促進作用，而高濃度的COS則抑制生長。卜寧［17］和胡曉珂［18］等報導ADO在一定濃度下能夠促進種子幼苗的生長，增強植物的光合作用，有利于葉片葉綠素的合成速率，提高種子的酶活力和葉片抗性。本試驗中，ADO是經過褐藻膠裂合酶降解褐藻膠得到的以二糖和三糖為主的ADO混合物，COS是由殼聚糖經酶解后再脫去部分乙酰基的衍生物，它們對植物的生長和生理活性的影響都得到了人們的重視。但關于ADO和COS對大麥種子萌發(fā)過程中生長情況和生理活性的綜合性比較鮮有報導。上述2種海洋寡糖對大麥種子萌發(fā)和生理特性的影響研究表明：當ADO和COS的濃度分別為0.5%和0.025%時，其對大麥種子的根長、苗長和質量以及葉綠素的含量、淀粉酶活力的影響最顯著。COS及ADO對根長和苗長的增量分別為對照的47.61%和20.44%、53.76%和33.47%。ADO與COS對大麥的促生長作用趨勢雖然類似，但ADO對大麥的促生長效果優(yōu)于COS。并且2種寡糖對根的作用效果較對苗的作用更加明顯。相對于ADO而言，COS的可選促進濃度遠低于ADO。在種子生長萌發(fā)過程中，由于不同種類種子的生長萌發(fā)狀態(tài)、生長代謝條件及細胞膜特性等均有差異，因此經研究會表現(xiàn)出不同的促生長濃度。隨著濃度的升高，COS對苗長的促進作用明顯較小，而對苗長促生長減小的趨勢較根長快，繼續(xù)升高COS濃度對種子萌發(fā)及幼苗生長起到抑制作用，因此應用COS時精確掌握COS的使用濃度極為重要。

本試驗中2種海洋寡糖對根長的促進作用較苗長更為明顯，表明寡糖的使用在能夠促進植物的光合作用的同時，更加強了種子的根系活力，有利于種子對營養(yǎng)物質的吸收和利用，進而提高作物的產量。經ADO（0.5%）和COS（0.025%）處理后的大麥種子淀粉酶活力及幼苗葉綠素含量也明顯高于對照組，說明一定量的寡糖可以促進植物體內酶類活性的增加并有效的提高大麥幼苗的光能利用率，對增強植物幼苗的抗性，促進幼苗健壯生長具有重要的作用。

研究結果同時表明2種海洋寡糖在對植物的促生長中都起到了激素性作用，但由于2種寡糖具有自身

的生理活性，對植物的促生長表現(xiàn)出差異性。ADO的促生長效果優(yōu)于COS，但是使用較低劑量的COS便可促進大麥的生長，ADO（0.5%）的使用濃度高于COS（0.025%）。在本文中，初步分析發(fā)現(xiàn)2種寡糖的主要組分具有相近的分子量范圍，因此分子量對2種寡糖在促生長方面所引起的生理指標差異性影響較小。但ADO與COS對種子生長情況及生理活性的影響表明2種寡糖的分子結構、分子極性及帶電荷性與寡糖活性有密切關系。這與ADO分子片段是以醛酸（－COOH）或醛酸鹽（－COO－）的形式存在和COS分子的游離氨基酸（－NH2）在酸性條件下可以質子化而帶正電（－NH＋3）形成陽離子聚合物有密切的關系。在劉瑞志［4］和隋雪燕［12］的報道中證明不同種類的寡糖或聚糖類對植物的影響效果是存在差異的，COS在對植物的生長調節(jié)方面具有明顯的激素性作用，而ADO在此方面也表現(xiàn)出類似的特性，由于2種寡糖在分子結構及帶電荷性上的不同，因此對植物的促生長作用表現(xiàn)出不同的最佳促進濃度和促進效果。通過以上對2種寡糖的對比研究，在對海洋寡糖的開發(fā)利用中應針對不同的研究對象，合理選擇具有不同生理活性和功能的海洋寡糖，為開拓海洋寡糖在農業(yè)生產方面的應用提供一定的科學基礎和理論依據。

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Effects of Two Marine Oligosaccharides on Barley Seeds Germination and Physiological Characters

WANG Ting－Ting，ZHAO Li，XIA Xuan，WANG Peng，JIANG Xiao－Lu
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Two marine oligosaccharides with similar molecular weight and different electric charge：Alginate－derived Oligosaccharide（ADO）and Chitosan Oligosaccharide（COS）were evaluated for the effects of different concentrations on seedling growth situation and physiological characters of barley.The growth indexes include：seedling＇s height，root's length，seedling's weight，root's weight and the effects on barley seed amylase activity and chlorophyll content.The barley growth indexes the seed amylase activity and chlaophyll content reached the maximum when ADO and COS were at the concentration of 0.5%and 0.025%respectively compared with the control group significantly increased（P＜0.05）.These results indicate that these two marine oligosaccharides have similar effect but different of the best concentration was based on their different molecule structure，providing reference for rational development of these two marine oligosaccharides.

alginate－derived oligosaccharide（ADO）；chitosan oligosaccharide（COS）；barley；seedlings growth；physiological activity

Q53

A

1672－5174（2011）11－061－06

國家自然科學基金項目（30901122）；海洋公益性行業(yè)科研專項（201105028）資助

2011－03－16；

2011－04－24

王婷婷（1987－），女，碩士生。E－mail：smkxxwtt＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：jiangxl＠ouc.edu.cn

責任編輯 朱寶象