鐘 華，張春軍，趙 丹，石曉鵬，楊建峰，何 芳

（1新疆地方病與民族高發(fā)病實驗室，石河子832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，石河子832002；3鄖陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，十堰442000）

胱硫醚β－合成酶基因rs719037、rs719038多態(tài)性與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

鐘 華1，2，張春軍1，2，趙 丹3，石曉鵬1，楊建峰1，何 芳1，2

（1新疆地方病與民族高發(fā)病實驗室，石河子832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，石河子832002；3鄖陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，十堰442000）

研究新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓（EH）患者胱硫醚β－合成酶（CBS）基因多態(tài)性與EH的關(guān)系。采用整群抽取隨機抽樣的方式，以新疆沙灣縣733名哈薩克族人（EH組366人，對照組367人）為研究對象，進行流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢查，并采集血樣，采用SnaPshot技術(shù)進行基因分型。結(jié)果顯示：CBS rs719037基因型及等位基因在EH組和對照組分布差異無顯著性（P＞0.05）；CBS rs719038基因型及等位基因在EH組和對照組分布差異無顯著性（P＞0.05）。結(jié)論 新疆哈薩克族人群中存在CBS基因rs719038、rs719037多態(tài)性位點。同時rs719038、rs719037位點與EH缺乏關(guān)聯(lián)。

CBS；基因多態(tài)性；高血壓；新疆哈薩克族

心血管疾病是危害各國人民健康的主要疾病，其發(fā)病率在我國呈逐年升高趨勢，已成為我國慢性非傳染性疾病的防治重點，其中原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是最常見的心血管疾病之一。國際衛(wèi)生組織（World Health Or ganization，WHO）于1978年公布的澳大利亞、日本、新西蘭、美國高血壓發(fā)病率為8%～18%。我國15歲以上人群高血壓患病率在1959年、1979年、1991年分別是5.11%、7.73%1、11.88%，呈逐年升高的趨勢［1－2］。1991年我國的高血壓普查，15歲及以上人口中高血壓患病率為患病人數(shù)9000萬人，其中新疆哈薩克族和漢族的高血壓患病率分別為18.97%、13.88%，哈薩克族明顯高于漢族，且均高于我國平均發(fā)病率11.88%［1－3］。2006年度全國健康狀況普查結(jié)果顯示，西部人的健康狀況不如東部，新疆人的健康狀況在2006年的全國健康狀況普查中排列在倒數(shù)第一。1991年、1999年、2004年、2007年流行病學(xué)調(diào)查顯示：哈薩克族高血壓患病率分別是18.97%、32.8%、40.5%、52.39%，呈逐年升高的趨勢［2－4］，歷次高血壓流行病學(xué)調(diào)查資料均顯示：新疆哈薩克族人群是高血壓病的易感人群，是我國高血壓患病率較高的民族之一，居全國各民族的前5位［3］，有著鮮明的民族聚集和高發(fā)的特征。

胱 硫 醚 β－合 成 酶 （cystat hionineβ－synthase，CBS）是一種吡哆醛磷酸依賴性酶，其催化同型半胱氨酸與絲氨酸縮合成胱硫醚。CBS作為同型半胱氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，當(dāng)其缺陷時可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥。近年來，血漿同型半胱氨酸（ho mocysteine，HCY）增加作為EH的危險因子越來越受到重視［5］，研究發(fā)現(xiàn)血漿HCY水平升高與EH有著密切的聯(lián)系。

本研究采用多重單堿基延伸反應(yīng)（SNaPshot）技術(shù)對CBS基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點進行分析，以探討哈薩克族CBS基因多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)，旨在為個體風(fēng)險的評價提供可行的手段，為哈薩克族族EH的防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在新疆沙灣縣博爾通古鄉(xiāng)流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，選擇年齡18歲以上72歲以下，至少三代在本地居住的哈薩克族居民，非一、二級親屬，無血緣關(guān)系，無異族通婚史。

病例組納入標(biāo)準：根據(jù)1999年 WHO／SIO診斷標(biāo)準，收縮壓≥140 mm Hg和（或）舒張壓≥90 mmHg，常規(guī)檢查排除繼發(fā)性高血壓、心肌梗死、過量飲酒、服用避孕藥史，無糖尿病、甲狀腺及肝腎疾病史等。

本次調(diào)查EH組366例（男性159人，女性207人，平均年54歲），對照組367名 （男性160人，女性207人，平均年齡51歲）。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查方法

患者在3個不同時間安靜狀態(tài)下測量血壓值的平均值，收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 k Pa）和（或）舒張壓≥90 mmHg為高血壓；收縮壓＜140 mm Hg和舒張壓＜90 mm Hg，無服用降壓藥史、高血壓家族史及其他器質(zhì)性心臟病史等為健康對照。采用整群抽取隨機抽樣法，抽取博爾通古鄉(xiāng)居民，由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員入戶進行問卷調(diào)查和檢測。包括吸煙、飲酒、食鹽量、膳食情況、家族史、高血壓史、血壓、身高、體重、腰圍、臀圍測量及生化指標(biāo)檢測等。

1.2.2 標(biāo)本采集

待檢者均禁食12 h，于次日清晨空腹抽取肘靜脈血6 mL，置乙二胺四乙酸（EDTA）于抗凝管中，2500 r／min離心5 min，取血清，置－20℃保存，用于血脂、血糖等常規(guī)生化檢測（當(dāng)日測定）。

1.2.3 基因組DNA提取

全血采用酚－氯法提取DNA。

1.2.4 CBS基因片段擴增

設(shè)計PCR引物用于擴增包含SNP位點的片段，及緊鄰SNP位點的延伸引物用于單堿基延伸。檢索美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）公共數(shù)據(jù)庫中SNP位點序列，用Pri mier3軟件設(shè)計PCR引物及延伸引物。引物如下：

上游：5′－TCTGTGTGTCTGGCCTTATGGTG－3′；

下游：5′－CGTGCTGGGATCCAATAAGCTC－3′。

PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.0μL，25 mm Mg Cl21.2μL，d NTP 0.6μL，多重PCR引物2.0μL，Hotstar Taq聚合酶0.2μL，DNA模板1.0μL，去離子水11.0μL，總體系20.0μL。

1.2.5 CBS基因片段的多態(tài)性檢測

用SNaPshot分型技術(shù)進行t SNP位點分型。PCR產(chǎn)物延伸反應(yīng)即單堿基延伸反應(yīng)。rs719037單堿基延伸引物序列如下：

5′－GATCCTACAGCTTTGTTCTTTTACAAT－3′。

rs719037單堿基延伸引物序列如下：

5′－ATGATGTATCCTGATGTATTTGTCC－TT－3′。

延伸反應(yīng)體系（10μL）包括5.0μL SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2.0μL純化后PCR產(chǎn)物，1.0μL延伸引物，2.0μL超純水。PCR循環(huán)程序：96℃預(yù)變性1 min；28循環(huán)×（96℃ 變性30 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s）；60℃延伸1 min；4℃保存。延伸產(chǎn)物純化，在10.0μL延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。最后延伸產(chǎn)物置3130XL（ABI）測序儀上，取0.5μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5μL Liz120 SIZE STANDARD，9.0μL Hi－Di混勻，95℃變性5 min后上ABI3130XL測序儀。

在測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)，用Gene Mapper 4.0軟件 （美國 Applied Biosystems有限公司）進行分析，以及判斷結(jié)果是否成功。

1）由于生產(chǎn)力的發(fā)展，工業(yè)的不斷進步，或者產(chǎn)品的更新?lián)Q代，他們的就業(yè)崗位是不斷變化的，需要高職生具有很強的適用能力來快速滿足換崗要求。因此，要用動態(tài)的眼光來研究他們的就業(yè)崗位，傳統(tǒng)的一個人在一個崗位靜態(tài)工作幾十年的狀態(tài)將不復(fù)存在。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計算兩組基因型頻率以確認是否符合Har dy－Weinberg遺傳平衡。

計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，由基因型頻率計算等位基因頻率，組間等位基因頻率和基因頻率比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆哈薩克族EH組與對照組的臨床相關(guān)指標(biāo)比較

由表1可知：各組的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、體重指數(shù)、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白的平均水平兩組間均有差異（P＜0.05），EH組均高于對照組；其余指標(biāo)兩組間無差異（P＞0.05）。

表1 新疆哈薩克族EH組與對照組的臨床相關(guān)指標(biāo)比較Tab.1 Clinical paraments of essemtial hypertension in the Kazakh and control subjects

2.2 哈薩克族CBS基因t SNP及單堿基延伸電泳峰型

結(jié)果見圖1～3。

圖1中橙色峰為SIZE STANDARD，藍色、綠色、紅色、黑色峰分別代表延伸加入dd GTP、dd ATP、dd TTP和dd CTP的延伸產(chǎn)物，峰下面標(biāo)注的等位基因。

圖2為rs719037位點單堿基延伸圖。根據(jù)測序圖的單峰、雙峰來判斷基因型，單峰為純合基因型，雙峰為雜合基因型。

圖1 新疆哈薩克族不同SNP單堿基延伸電泳峰型Fig.1 SNP shot electropherogram result of SNPs in Kazakh groups

圖2 rs719037位點單堿基延伸電泳峰型Fig.2 SNP shot electropherogram result of rs719037

圖3 rs719038位點單堿基延伸電泳峰型Fig.3 SNP shot electropherogram result of rs719038

2.3 CBS基因型及等位基因在新疆哈薩克族EH組與對照組中的分布及患病風(fēng)險估計

2.3.1 新疆哈薩克族rs719037位點基因型及等位基因分布

結(jié)果見表2。

由表2可見：rs719037位點基因型分布符合Har dy－Weinber g遺傳平衡（P＞0.05），提示該人群有較好的代表性；rs719037位點基因型及等位基因在EH組與對照組間無差異。

表2 新疆哈薩克族rs719037位點基因型及等位基因分布Tab.2 Distribution of the genotypes and alleles of rs719037 in the Kazakh group

2.3.2 rs719038多態(tài)性基因型及等位基因分布

結(jié)果見表3。

由表3可見，rs719038位點基因型分布符合Har dy－Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），提示該人群有較好的代表性。表3中，rs719038位點基因型及等位基因在EH組與對照組間無差異。

表3 新疆哈薩克族rs719038位點基因型及等位基因分布Tab.3 Distribution of the genotypes and alleles of rs719038 in the Kazakh group

3 討論

原發(fā)性高血壓是最常見的心血管疾病之一，已成為我國慢性非傳染性疾病的防治重點。目前EH的病因尚不完全清楚，可能是一類有多基因和環(huán)境因素共同影響導(dǎo)致的復(fù)雜遺傳性疾病。新疆歷次高血壓流行病學(xué)調(diào)查資料均顯示：新疆哈薩克族是高血壓的易感人群［2－4］，提示新疆哈薩克族可能具有不同的遺傳和環(huán)境背景。其確切的發(fā)病機制尤其是哈薩克族EH高發(fā)的分子遺傳機制有待進一步闡明。

該民族人群是一個相對隔離群體，影響血壓的環(huán)境因素，如生存環(huán)境、飲食習(xí)慣（高鹽，高動物脂肪攝入），生活方式和精神壓力等均較為一致，一定程度地減少了遺傳異質(zhì)性的影響；受當(dāng)?shù)蒯t(yī)療條件的限制，絕大多數(shù)EH患者均未經(jīng)服藥治療，故所測血壓能客觀地反映人群的實際血壓水平，這些都減少了影響統(tǒng)計結(jié)果的混雜因素，新疆哈薩克族是進行高血壓分子流行病學(xué)研究的理想人群。

人類胱硫醚β－合成酶是一種吡哆醛磷酸依賴性酶，以63 k Da的同源四聚體形式存在，它催化同型半胱氨酸與絲氨酸縮合成胱硫醚。CBS作為同型半胱氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，CBS基因突變可能影響CBS亞單位與血紅素和5′－磷酸吡哆醇的相互作用，從而使酶活性降低，導(dǎo)致高HCY血癥。高HCY血癥是一種獨立的危險因素，血漿HCY水平與心腦血管事件的發(fā)生率呈顯著的正相關(guān)［6－8］。高HCY可通過多種機制損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致靶器官的損害。CBS基因錯義突變是引起CBS缺乏或活性下降的主要機制。一旦CBS基因突變引起酶活性改變，必然導(dǎo)致HCY降解受阻，造成HCY在血液中蓄積而產(chǎn)生高同型半胱氨血癥。目前，越來越多的研究表明，胱硫醚合成酶基因多態(tài)性與心腦血管疾病和出生缺陷如神經(jīng)血管畸形的發(fā)生有關(guān)［9－11］。

CBS基因多態(tài)性及與不同疾病關(guān)系具有種族、民族及地域間的差異，有關(guān)CBS基因多態(tài)性與新疆哈薩克族高血壓的相關(guān)性研究未見報道。利用聚合酶鏈反應(yīng)－限制片長多態(tài)性（PCR－RFLP）等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CBS基因中的基因多態(tài)位點至少有80個，不同的多態(tài)位點對CBS活性的影響不盡相同［12－14］。我們從人類基因庫中選取雜合突變頻率高的CBS基因位點rs719037、rs719038進行研究。

首先在分析EH發(fā)生的危險因素后發(fā)現(xiàn)，超重、肥胖是新疆哈薩克族的危險因素，說明脂肪在EH的發(fā)病過程中起重要作用，在新疆哈薩克族表現(xiàn)尤為明顯，這與哈薩克族膳食結(jié)構(gòu)中動物脂肪攝入較多有關(guān)。已有研究表明，血脂代謝異常（主要是指血漿中甘油三酯和總膽固醇以及低密度脂蛋白的濃度升高）是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一。本研究的結(jié)果顯示哈薩克族EH人群中血漿總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白較對照組明顯增高。上述研究結(jié)果提示：環(huán)境因素在哈薩克族EH高發(fā)的機制中可能占有重要地位，其中超重、肥胖、腹部肥胖、血脂代謝紊亂、蔬菜攝入不足是新疆哈薩克族EH危險因素。因此，控制體重、降低血脂，改善飲食習(xí)慣和不良生活行為有助于預(yù)防新疆哈薩克族EH的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)在新疆哈薩克族EH組CBS基因rs719037位點存在GG、GA和AA三種基因型，頻率分別為14.2%、44.3%、41.5%，等位基因 G 和 A頻率分別為36.3%和63.7%：在對照組同樣檢測到GG、GA和AA三種基因型和G、A兩種等位基因，AA、AG和GG三種基因型的頻率分別為12%、51.2%和36.8%，G和A兩種等位基因頻率分別為27.6%和62.4%。兩組基因型和等位基因頻率分布無統(tǒng)計學(xué)差別；EH組CBS基因rs719038位點存在CC、CT和TT三種基因型，頻率分別為24.9%、48.6%、26.5%和，等位基因C和T頻率分別為49.2%和50.8%：在對照組同樣檢測到CC、CT和TT三種基因型和C、T兩種等位基因，CC、CT和TT三種基因型的頻率分別為22.1%、54.5%和23.4%，C和 T兩種等位基因頻率分別為49.3%和50.7%。兩組基因型和等位基因頻率分布無統(tǒng)計學(xué)差別。以上的研究結(jié)果提示rs719037、rs719038多態(tài)性可能與新疆哈薩克族EH不相關(guān)。

新疆哈薩克族EH組和對照組CBS基因rs719037、rs719038位點基因型和等位基因頻率無差異可能和樣本量不夠大提供的信息量有限有關(guān)，并且EH是一多基因復(fù)雜性疾病，在多基因復(fù)雜性疾病研究中，由多個變異位點組合構(gòu)成的單倍型分析蘊含較單個位點更大的信息量，以單倍型為基礎(chǔ)進行的分析所得出的結(jié)論將明顯優(yōu)于單核苷酸多態(tài)性的分析。另外，單個基因的變異不足以引起疾病，需要多個基因的聯(lián)合作用（協(xié)同效應(yīng)），在環(huán)境因素的參與下，個體才會發(fā)病。因此我們在下一步的研究中將擴大樣本量并進行多個相關(guān)基因多態(tài)性的分析，找出遺傳易感性的單倍體形式，聯(lián)合多種相關(guān)基因表達的血漿水平及相關(guān)酶催化效率來探討EH等相關(guān)性心血管疾病的發(fā)病機制。如果能夠闡明基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)系，就可通過基因檢測篩檢易感人群，為疾病的一級預(yù)防提供可行的手段，為個體危險度的評價提供重要的方法。

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Association bet ween CBS Gene Poly morphisms and Essential Hypertension in the Kazakh of Xinjiang

ZHONG Hua1，2，ZJANG Cunjun1，2，ZHAO Dan3，SHI Xiaopeng1，YANG Jianfeng1，HE Fang1，2
（1 Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002，China；2 Depart ment of Pathophysiology，Medical College，Shihezi University，Shihezi 832002，China；3 Depart ment of Physiology，Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

We investigate the relationship bet ween gene poly morphis ms in the cystathionineβ－synthase（CBS）with essential hypertension（EH）in the Kazakh population.Based on the case－control study，we selected 733 （366 EH，367 controls）Kazakh fro m the Boertonggu countryside of Shawan region in Xinjiang Uygur Autono mous Region of China by rando m cluster sampling.After questinnaires and physical examinations，we collected blood.The poly morphisms of CBS in the studygrops were detected with SnaPshot assays.The results showed the frequencies of genotypes and alleles of rs719037 had no differences between EH and contrl group（P＞0.05）；there was no difference in the genotypes and alleles of rs719038 bet ween EH and contrl group.（P＞0.05）.The conclusions was that there were poly mor phis ms at rs719038 and rs719037 of CBS gene，but there was a lack of associated with EH in the Kazakh of Xinjiang.

cystathionineβ－synthase；gene poly mor phis ms；hypertension；the Kazakh of Xinjiang

R544.1

A

1007－7383（2011）06－0716－06

2011－09－20

國家自然科學(xué)基金項目（30760077），新疆兵團重點領(lǐng)域科技攻關(guān)項目（2011BA059）

鐘華（1973－），女，講師，從事心血管病理生理學(xué)研究；e－mail：7151zhhua＠sohu.co m。

何芳（1964－），女，教授，碩士導(dǎo)師，從事心血管病理生理學(xué)研究；e－mail：fangf2002shz＠126.com。