王成義，閆茂倉(cāng)，陳少波，管敏鑫，單樂(lè)州，艾為明，謝起浪，蔡延馬奔

(1.溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325005；2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005；

3.浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005；4.Division of Human Genetics and Center for Hearing and Deafness Research, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio 45229, USA; 5.溫州市工業(yè)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325028）

基于16S rRNA和recA香魚(yú)鰻利斯頓氏菌的分離鑒定

王成義1,2,3，閆茂倉(cāng)2,3，陳少波2,3，管敏鑫1,4，單樂(lè)州2,3，艾為明1，謝起浪2,3，蔡延馬奔5

(1.溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325005；2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005；

3.浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005；4.Division of Human Genetics and Center for Hearing and Deafness Research, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio 45229, USA; 5.溫州市工業(yè)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325028）

為研究引起香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)出血潰爛癥病因及致病菌系統(tǒng)發(fā)育地位，本研究從患病香魚(yú)的肝臟、腎臟及體表分離到11株病原菌（編號(hào)：X0901-X0911），運(yùn)用常規(guī)細(xì)菌生理生化方法鑒定致病菌所屬種類；運(yùn)用16S rRNA基因、recA基因序列分析方法研究致病菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果表明：致病菌為鰻利斯頓氏菌，11株細(xì)菌生理生化結(jié)果相同，均為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶陽(yáng)性、接觸酶陽(yáng)性、吲哚陽(yáng)性、精氨酸脫羧酶陽(yáng)性、精氨酸雙水解酶陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、甘露醇陽(yáng)性、MR測(cè)定陽(yáng)性；H2S陰性、V-P測(cè)定陰性等。根據(jù)16S rRNA基因、recA基因序列分別構(gòu)建弧菌科常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明：致病菌與鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）均聚為一枝，聚類結(jié)果與細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果相符。致病菌與鰻利斯頓氏菌16S rRNA基因、recA基因的同源性分別為99.9%、99.8%。以recA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)與16S rRNA基因建樹(shù)結(jié)果相類似。此外，與16S rRNA基因相比，recA基因在不同物種之間具有更高的鑒別能力，本研究表明recA基因適合作為弧菌科常見(jiàn)細(xì)菌物種間進(jìn)化關(guān)系研究的標(biāo)記。

香魚(yú); 鰻利斯頓氏菌; 分離; 鑒定

引 言

香魚(yú) (Plecoglossus altivelis) 隸屬于鮭形目，香魚(yú)科，香魚(yú)屬。是一種小型名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，在當(dāng)今國(guó)際市場(chǎng)上享有“淡水魚(yú)之王”的美稱，由于工業(yè)的發(fā)展及人為的濫捕，造成天然香魚(yú)種群日益減少，目前已處于瀕危的狀態(tài)，被國(guó)家列為二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。1998年發(fā)布的《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》把香魚(yú)列入易危動(dòng)物[1]。在香魚(yú)高密度人工養(yǎng)殖過(guò)程中極易出現(xiàn)病害，特別是在香魚(yú)幼苗階段易出現(xiàn)由鰻利斯頓氏菌（原：鰻弧菌vibrio anguillarum）、假單胞菌 (Pseudomonassp.)、鏈球菌 (Streptococcussp.）、柱狀屈撓桿菌 （Flexibacter columnaris）、殺魚(yú)巴斯德菌 (Past.Piscicida) 等引起的細(xì)菌性疾病，其中尤其以鰻利斯頓氏菌引發(fā)的出血潰爛病的影響最為嚴(yán)重[2]。

鰻利斯頓氏菌是一類革蘭氏陰性菌，最早于1761年發(fā)現(xiàn)于歐洲，Bonaveri[3]將該病描述為紅疫病，曾在18-19世紀(jì)意大利的海水養(yǎng)殖鰻鱺中流行，造成嚴(yán)重死亡。1909年，Bergman[4]從瑞典沿海養(yǎng)殖的患紅疫病鰻鱺中分離到病原菌，并將其命名為鰻弧菌。MacDonnell和Colwell[5]在1985年將歸屬到利斯頓菌屬(Listonella)。鰻利斯頓氏菌是一種條件致病菌，能夠引起多種水產(chǎn)動(dòng)物疾病，如：鮭魚(yú) (Stenodus leucichthys)、虹鱒 (Salmo grairdneri)、鰻鱺、香魚(yú)、鱸魚(yú) (Lateolabrax japonicus)、鱈魚(yú) (Gadus callarisa)、大菱鲆 (Scophthatmus maximus)、牙鲆 (Paralichthys olivaceus)、大黃魚(yú) (Pseudosciaena crocea) 等[4,6-11]。

迄今為止，在細(xì)菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育地位研究方面，16S rRNA依然是最常用的分子工具。細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)為16S rRNA的同源性大于97.5%的細(xì)菌可視為同種[12]，然而弧菌科許多不同種細(xì)菌的同源性大于97.5%[13]，已經(jīng)不能準(zhǔn)確的確定待測(cè)菌株的系統(tǒng)分類學(xué)地位。在這種前提下，許多學(xué)者將視線轉(zhuǎn)移到其他的持家基因作為系統(tǒng)分類學(xué)研究工具[14,15]。Zeigler[16]研究指出單個(gè)基因也可以很好的預(yù)測(cè)整個(gè)基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。recA基因是廣泛存在于細(xì)菌中重要的持家基因，編碼一種多功能蛋白質(zhì)，其功能主要涉及：同源重組、DNA修復(fù)、SOS反應(yīng)、單鏈DNA結(jié)合、DNA解螺旋、同源重組中尋找同源位點(diǎn)[17,18]。recA基因被用于研究Burkholderia屬所有細(xì)菌的分類，證明是有效的鑒定工具[19]。Thompson等[14]利用recA做標(biāo)記研究弧菌科細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明recA基因比16S rRNA具有更好的辨別能力，適合做為弧菌科細(xì)菌鑒定的工具。

本研究運(yùn)用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法和16S rRNA基因和recA基因序列分析相結(jié)合的方法研究了引起香魚(yú)出血潰爛病致病菌的系統(tǒng)分類學(xué)地位。目的在于研究香魚(yú)的出血潰爛癥的病因，為香魚(yú)健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、香魚(yú) 菌株分離自典型的出血潰爛癥狀的香魚(yú)；患病香魚(yú)采自樂(lè)清市某香魚(yú)育苗場(chǎng)，健康香魚(yú)來(lái)自浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江試驗(yàn)場(chǎng)。

1.1.2 試劑 PCR擴(kuò)增試劑盒、DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)、UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（SK1202）均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，細(xì)菌鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 取患出血病瀕臨死亡的香魚(yú)，用70%酒精消毒體表，用無(wú)菌的剪刀剪破病魚(yú)的體腔壁，在無(wú)菌條件下挑取肝胰臟、腎臟接種于ZOBELL 2216E和TCBS培養(yǎng)基，將平板置于30℃條件下培養(yǎng)24 h挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落，進(jìn)一步劃線純化，經(jīng)純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到ZOBELL 2216E海水斜面

培養(yǎng)基上，于4℃保存、備用。

1.2.2 人工感染試驗(yàn) 選取純化后的4株代表細(xì)菌用于人工感染試驗(yàn)，方法是將供試菌株分別接種于ZOBELL 2216E海水培養(yǎng)基試管斜面，于30℃培養(yǎng)18 h，加入0.65%無(wú)菌的生理鹽水沖洗菌落，配成菌懸液調(diào)整細(xì)菌濃度約為5.2×108個(gè)/mL，每尾香魚(yú)胸腔注射0.2 mL菌液；另設(shè)對(duì)照組，每尾魚(yú)注射相同劑量0.65%的無(wú)菌生理鹽水，每組香魚(yú)的數(shù)量為10尾。注射后觀察香魚(yú)的發(fā)病死亡情況，并對(duì)死亡香魚(yú)及時(shí)剖檢和致病菌的再次分離。

1.2.3 形態(tài)觀察及生理生化鑒定 觀察致病菌ZOBELL 2216E和TCBS培養(yǎng)基平板的菌落的形態(tài)特征，分別取11株致病菌的ZOBELL 2216E海水培養(yǎng)基試管斜面30℃的18 h培養(yǎng)物，制備相應(yīng)的涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察個(gè)體形態(tài)、大小。按傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法較系統(tǒng)地測(cè)定致病菌相關(guān)的理化特征指標(biāo)。1.2.4 致病菌基因組DNA提取 將致病菌株分別接種于ZOBELL 2216E海水培養(yǎng)基試管斜面，于30℃培養(yǎng)18 h，加入0.65%無(wú)菌的生理鹽水沖洗菌落，配置成為菌懸液。后依據(jù)UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)所示方法提取致病菌的總DNA?；蚪MDNA于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)模板的純度和完整性。

1.2.5 16S rRNA基因和recA基因的PCR擴(kuò)增、測(cè)序 使用primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)鰻利斯頓氏菌recA基因的特異性引物,并使用16S rRNA基因細(xì)菌通用引物擴(kuò)增，引物如表1所示。16S rRNA基因和recA基因50μl擴(kuò)增反應(yīng)體系中含有：5 μl 10×buffer，MgCl22 mM，引物各0.2 μM，dNTPs各0.25 mM，Taq DNA聚合酶1.25 U，模板DNA約50 ng。反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行，16S rRNA擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性10 min、94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃保溫10 min。recA基因擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性10 min、94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃保溫10 min。反應(yīng)完畢后分別取5 μl于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生物工程技術(shù)公司測(cè)序。1.2.6 序列分析及數(shù)據(jù)處理 通過(guò)Blast軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與16S rRNA基因和recA基因同源性較高的細(xì)菌基因序列，并從中選取與所待測(cè)細(xì)菌16S rRNA基因和recA基因同源序列，采用Clustal X 2.0軟件[20]進(jìn)行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用RDP3.34軟件檢測(cè)recA基因同源序列之間的基因重組事件。使用DNASTAR軟件分別計(jì)算16S rRNA基因和recA基因的序列相似性。用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA4.0[21]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，計(jì)算recA基因的GC含量和堿基置換和顛換的比例；在Kimura-2-parameter 模型的基礎(chǔ)上，用Neighbor-joining 法分別構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，自舉分析（Bootstrap）1000次重復(fù)檢測(cè)分子系統(tǒng)樹(shù)的置信度，缺失和不確定的位點(diǎn)在計(jì)算中被省略，使用其他的建樹(shù)方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)比較確定NJ樹(shù)聚類關(guān)系的準(zhǔn)確性。

表1 PCR擴(kuò)增的引物Tab.1 the primers used in the PCR amplifications

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離

從上述患病香魚(yú)的肝胰臟和腎臟中分離得到的細(xì)菌，在ZOBELL 2216E和TCBS培養(yǎng)基平板上分別得到形態(tài)特征相似的菌落。經(jīng)過(guò)3次的平板劃線純化得到11株細(xì)菌其編號(hào)分別為：X0901至X0911。將純化后的細(xì)菌接種于ZOBELL 2216E海水培養(yǎng)基試管斜面，30℃培養(yǎng)18 h后，于4℃冰箱中保存供鑒定和基因組DNA提取使用。

2.2 人工感染試驗(yàn)

自然發(fā)病的香魚(yú)體表充血潰爛、肛門紅腫、腹部腫脹等。香魚(yú)在接種菌懸液后12 h內(nèi)全部發(fā)病死亡；對(duì)照組的10尾香魚(yú)養(yǎng)殖觀察10 d均正常存活。剖檢可見(jiàn)接種菌懸液香魚(yú)臨床特征與自然病例樣類似但癥狀較輕。以菌液感染死亡的香魚(yú)肝胰臟和腎臟為材料，通過(guò)平板分離純化的細(xì)菌與供試菌類似，對(duì)健康的香魚(yú)進(jìn)行重復(fù)感染，同樣可得到與自然病例樣類似但臨床癥狀較輕的病變。供試菌為香魚(yú)出血潰爛病的病原菌。

2.3 形態(tài)及菌落特征

2.4 生理生化特征

對(duì)致原菌作生化管鑒定，內(nèi)容和結(jié)果見(jiàn)表1。11株細(xì)菌的生理生化特征完全相同，均為氧化酶陽(yáng)性、接觸酶陽(yáng)性、甘露醇陽(yáng)性、吲哚陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、MR測(cè)定陽(yáng)性、精氨酸脫羧酶陽(yáng)性、精氨酸雙水解酶陽(yáng)性；VP測(cè)定為陰性；利用葡萄糖、甘露糖和蔗糖產(chǎn)酸，參考《伯杰鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（第9版）[22]得知與鰻利斯頓氏菌的生理生化特征非常相似。

表2 分離菌株的生理生化特征Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of Strains

2.5 細(xì)菌DNA提取結(jié)果及擴(kuò)增

細(xì)菌基因組DNA的純度和完整性較好適合作PCR擴(kuò)增模板。16S rRNA基因和recA基因的電泳結(jié)果如圖1所示。11株致病菌的16S rRNA基因和recA基因序列測(cè)定結(jié)果完全相同，表明11株致病菌屬于同種細(xì)菌，序列已提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為：GQ4098612、GQ409861。

16S rRNA基因擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為1 393 bp，約占16S rRNA基因總長(zhǎng)度的93%，擴(kuò)增片段的GC含量為54.4%。用于建樹(shù)的16S rRNA基因置換與顛換的比率k（嘌呤）= 1.719；k（嘧啶）= 3.084，置換顛換的總體偏差R=1.172。recA基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為534 bp，約占recA基因總長(zhǎng)度的50%，擴(kuò)增片段的GC含量為45.3%。用于建樹(shù)的recA基因置換與顛換的比率k（嘌呤）=2.646；k（嘧啶）= 3.796，置換顛換的總體偏差R=1.513。DNASTAR計(jì)算得出致病菌16S rRNA基因與鰻利斯頓氏菌16S rRNA基因的同源性大于99.9%；recA的同源性為99.8%。使用RDP3.34軟件并沒(méi)有檢測(cè)到不同物種之間存在基因重組事件。利用16S rRNA基因和recA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖 1 16S rRNA基因和recA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖 2 根據(jù)16 S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Molecular phylogenetic tree based on 16 S rRNA gene sequences

圖 3 根據(jù)recA基因構(gòu)建序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Molecular phylogenetic tree based on recA gene sequences

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從出血潰爛病香魚(yú)體內(nèi)分離出11株致病菌，通過(guò)對(duì)致病菌的生理生化特征鑒定表明致病菌為鰻利斯頓氏菌。在細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位研究方面，16S rRNA基因是最主要的分子工具，被廣泛的應(yīng)用于各種微生物系統(tǒng)發(fā)育地位研究。細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)為16S rRNA的同源性大于97.5%的細(xì)菌可視為同種。

隨著新物種的發(fā)現(xiàn)，許多不同物種之間16S rRNA的同源性遠(yuǎn)大于97.5%，已不能夠準(zhǔn)確反映它們發(fā)育學(xué)地位。在這種前提下，國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛將視線轉(zhuǎn)移到其他靶位點(diǎn)。Zeigler[16]提出用于系統(tǒng)發(fā)育研究的靶基因應(yīng)該滿足4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即：1.靶基因必須廣泛的分布于所有生物的基因組中；2.靶基因必須在給定物種的基因組中只出現(xiàn)一次；3.靶基因序列必須足夠長(zhǎng)，包含足夠的信息，以及便于測(cè)序研究；4.序列必須能夠預(yù)測(cè)所有物種的親緣關(guān)系，并具有可以接受的精度和準(zhǔn)確度，聚類結(jié)果與16S rRNA的鑒定結(jié)果和DNA

分子雜交結(jié)果相符。同時(shí)指出單個(gè)基因也可以很好的預(yù)測(cè)整個(gè)基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。recA基因是廣泛存在于細(xì)菌中重要的持家基因，編碼一種多功能蛋白質(zhì)[17,18]。recA基因被用于研究Burkholderia屬所有細(xì)菌的分類，證明是有效的鑒定工具[19]。Thompson等[14]利用recA做標(biāo)記研究弧菌科細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明recA基因比16S rRNA具有更好的辨別能力，適合做為弧菌科細(xì)菌鑒定的工具。本研究為進(jìn)一步確定致病菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位，我們使用細(xì)菌16S rRNA通用引物并設(shè)計(jì)鰻利斯頓氏菌recA基因的特異性引物，擴(kuò)增了致病菌的16S rRNA基因和recA基因的部分片段，并分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。建樹(shù)結(jié)果表明致病菌均能夠和鰻利斯頓氏菌聚為一類，16S rRNA基因和recA基因的序列同源性分別為99.9%和99.8%，聚類結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果相一致。比較兩株進(jìn)化樹(shù)可以得知相同弧菌在進(jìn)化樹(shù)上的拓?fù)鋵W(xué)位置大致相符合。

Listonella anguillarum與Vibrio ordalii具有極近的親緣關(guān)系，16S rRNA基因和recA基因的序列同源性分別為99.0%、97.6%，這一結(jié)果和DNA雜交試驗(yàn)得出的結(jié)論相一致[23]；Vibrio cholerae與Vibrio mimicus親緣關(guān)系較近，但是比較兩株進(jìn)化樹(shù)可知它們的發(fā)育學(xué)地位并不完全一致，根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)樹(shù)結(jié)果兩種不同的細(xì)菌混雜在一起，而依據(jù)recA基因建樹(shù)的結(jié)果能夠把兩種不同的細(xì)菌分開(kāi)，Vibrio cholerae與Vibrio mimicus的16S rRNA基因和recA基因的序列同源性分別為99.4% ～ 99.6%、92.3% ～ 93.1%。Vibrio

parahaemolyticus、Vibrio alginolyticus、Vibrio harveyi和Vibrio campbellii四種細(xì)菌的親緣關(guān)系相對(duì)較近，建樹(shù)結(jié)果均可以將它們聚為一枝，但是Vibrio harveyi在16S rRNA構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中并沒(méi)有彼此聚在一起，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是由于這4株細(xì)菌的16S rRNA的序列彼此之間同源性大于99%，建樹(shù)方法已無(wú)法對(duì)它們分類學(xué)地位作出準(zhǔn)確的估計(jì)。在以recA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中Vibrio parahaemolyticus（EU051553）和Vibrio alginolyticus聚在一起，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因尚不明確，需要做進(jìn)一步研究確定這兩種菌的分類地位。Vibrio fluvialis和Vibrio vulnificus的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)并不相符，產(chǎn)生這種情況可能的原因有兩種，一是“長(zhǎng)枝吸引效應(yīng)”，是指在用系統(tǒng)發(fā)育分析方法分析一個(gè)有限數(shù)據(jù)集時(shí), 由于高頻率的相似變化(如趨同、平行進(jìn)化)和加速的進(jìn)化速率等因素的存在使序列達(dá)到相同狀態(tài)而人為地將這些不是來(lái)自于共同祖先的序列的代表分類元聚在一起, 使這些分類元之間相互“吸引”[24]。在使用外圍集團(tuán)確定樹(shù)根的過(guò)程中，一個(gè)明顯距離很遠(yuǎn)的外圍集團(tuán)很可能會(huì)擁有一個(gè)分歧非常大的序列，以至于內(nèi)部集團(tuán)將受到長(zhǎng)樹(shù)枝效應(yīng)的影響，把這個(gè)序列同內(nèi)部集團(tuán)放在一起[25]。二是recA片段提供的進(jìn)化信息不足，以致出現(xiàn)分類學(xué)地位模糊的現(xiàn)象。對(duì)上述結(jié)果產(chǎn)生的原因還需要再做進(jìn)一步的研究。總體來(lái)說(shuō)：與16S rRNA基因相比，recA基因在弧菌科常見(jiàn)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位分析中具有更好的鑒別能力。

[1]國(guó)家環(huán)保局, 中華人民共和國(guó)瀕危物種科學(xué)委員會(huì).中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)（魚(yú)類）[M].北京: 科學(xué)出版社, 1998, 47-49.

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Isolation and identification ofListonella anguillarumfromPlecoglossus altivelisbased on 16S rRNA and recA

WANG Cheng-yi1,2,3，YAN Mao-cang2,3，CHEN Shao-bo2,3，GUAN Min-xin1,4，SHAN Le-zhou2,3，AI Wei-ming1，XIE Qi-lang2,3，CAI Yan-ben5

(1.Wenzhou Medical College, 325005, China; 2.Zhejiang Mariculture Research Institute, 325005, China; 3.Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-resource, 325005, China; 4.Division of Human Genetics and Center for Hearing and Deafness Research, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio 45229, USA; 5.Wenzhou Engineering Graduate School, 325028, China）

In order to investigate the pathogen of bleeding ulcers ofPlecoglossus altivelisand the phylogenetic position of this pathogen, 11pathogen were isolated from liver, kidney and surface of diseasedPlecoglossus altiveliswith the NO.from X0901 to X0911.Routine bacterial identification was used to identify this pathogen and the phylogenetic position was investigated using 16S rRNA gene and recA gene sequences analysis.The results of physiological and biochemical tests suggested that they were gram-negative bacteria, and the results of oxidase, contact enzyme, producing indole, arginine decarboxylase, arginine dihydrolase, nitrate reduction tests and MR tests were positive; but they couldn’t generate H2S and the results of V-P test were negative too.Molecular phylogenetic trees of common bacterial were constructed and the results suggested that the pathogen andListonella anguillarumclustered with each other.And the results corresponded with that of routine bacterial identification.The identity of 16S rRNAgene and recA gene between pathogen andListonella anguillarumwere 99.9% and 99.8% respectively.The topology of phylogenetic tree constructed by recA gene was generally agreed with that of 16S rRNA gene.And recA gene was much more discriminatory than 16S rRNA gene.So the conclusion was recA gene was an alternative phylogenetic and identification marker for the common vibrios.

Plecoglossus altivelis; Listonella anguillarum; isolation; identification

P736.22+1

A

1001-6932(2010)01-0084-07

2009-09-22；

2009-11-06

浙江省科技廳科研院所專項(xiàng)公益技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目 (2007F10009)；浙江省科技廳科研院所青年人才計(jì)劃項(xiàng)目 (2006R20001)；溫州市科技興海項(xiàng)目 (S20070051)

王成義 (1984－)，男，在讀碩士，主要病害及遺傳學(xué)研究。電子郵箱：sciencew@163.com

陳少波， chenshaobo@hotmail.com