焦娟 趙滿倉 魏文青 劉晶 張艷 付瑤

·論著·

人載脂蛋白A5單抗制備及臨床應用的研究

焦娟 趙滿倉 魏文青 劉晶 張艷 付瑤

目的制備抗人載脂蛋白A5(ApoA5)單克隆抗體(McAb)，建立ELISA雙抗體夾心法，并進行初步的臨床應用。方法利用合成的人ApoA5抗原免疫BALB/c小鼠，制備McAb，并對抗體的效價、特異性、亞類及位點進行了測定，建立了ELISA雙抗體夾心法，測定了正常對照組(145例)和冠心病組(68例)血清中ApoA5的含量。結果獲得了5個穩(wěn)定分泌抗體的陽性雜交瘤細胞株，且均為IgG2a型。腹水效價達到1.6×105。冠心病組膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和ApoB水平明顯高于對照組(P<0.05)，而高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、ApoA1和ApoA5水平明顯低于對照組(P< 0.05)。ApoA5與HDL-C、ApoA1水平呈正相關(r值分別為0.53和0.63，P<0.05)，與TC、TG、LDL-C、ApoB呈負相關(r分別為－0.69、－0.63、和－0.59，P<0.05)。結論ApoA5參與脂質代謝，對于心血管疾病的預防和治療具有一定的臨床意義。

載脂蛋白A類;抗體，單克隆;血脂;冠心病

載脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)是由Vander等［1，2］在2001年同期發(fā)現(xiàn)并證實的一個載脂蛋白家族新成員，其參與調節(jié)血脂代謝，尤其與三酰甘油(TG)關系密切，是與血漿TG水平呈負相關的載脂蛋白。血漿TG水平升高是動脈粥樣硬化和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的重要危險因素，高TG血癥已被列為冠心病的獨立危險因子。探討ApoA5與高脂血癥的相互關系，對于心血管疾病的預防和治療具有重要的理論和實際意義。我們利用生物技術合成ApoA5，偶聯(lián)載體蛋白制成抗原，免疫BALB/c小鼠，制備抗人ApoA5單克隆抗體。建立ApoA5－ELISA雙抗體夾心法，對實驗條件和影響因素進行了探索，并初步應用于臨床檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年9月至2008年11月門診體正常人145例作為正常對照組，男87例，女58例;年齡38～78歲，平均年齡60歲。選擇同期我院心內科確診的冠心病的患者68例(參考1979年WHO診斷標準)作為冠心病組，男42例，女26例;年齡41～83歲，平均年齡(61±8)歲。2組性別比、年齡間有均衡性。

1.2 試驗材料 BALB/c小鼠，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所實驗動物中心;SP2/0細胞株，由軍事醫(yī)學科學院動物所惠贈;弗氏佐劑，本實驗室自制;ApoA5抗原，由北京博奧森生物技術有限公司合成;羊抗鼠-HRP購自博奧森生物技術有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)，Sigma產品。ApoA1、ApoB抗原由衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學研究所惠贈。TG、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、ApoA1、ApoB試1盒、全自動生化分析儀均為羅氏公司產品。

1.3 方法

1.3.1 動物免疫:用常規(guī)免疫法免疫BALB/c小鼠，第1次用完全佐劑，第2、3次用不完全佐劑，第4次由脾臟直接注射。

1.3.2 抗ApoA5單克隆抗體(McAb)的制備:①細胞融合:取免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇(PEG)的作用下8∶1比例進行融合，10 d后檢測抗體，選取陽性孔，采用有限稀釋法克隆化，待克隆陽性率100%時，擴大培養(yǎng)，制備腹水。②抗體特異性測定:固相載體分別包被ApoA5、ApoA1、ApoB和人血清白蛋白，用ELISA法測定。抗體的Ig及亞類鑒定采用雙相免疫擴散法。③抗體的效價測定:取上清和腹水，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成不同濃度，用ELISA法測定其效價。

1.3.3 ApoA5 ELISA測定方法的建立:利用制備的 ApoA5 McAb，建立ELISA雙抗體夾心法，并對實驗條件進行優(yōu)化。利用棋盤滴定的方法對包被抗體的濃度、血清稀釋倍數(shù)、酶標抗體的稀釋倍數(shù)進行了選擇。

1.3.4 其他生化指標測定:TG、TC、HDL-C、LDL-C采用酶法測定;ApoA1、ApoB采用免疫比濁法用羅氏全自動生化分析儀進行測定。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以ˉx±s表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗人ApoA5單克隆抗體的制備及免疫學分析 按常規(guī)法免疫，取小鼠眼睛血，經檢測效價為1∶64。取免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，篩選出陽性的雜交瘤細胞株5個，分別命名為A51、A52、A53、A54和A55。經檢測，陽性細胞株上清效價達到1∶256;腹水效價達到1.6×105;5株McAb與ApoA5特異性反應，與ApoA1、ApoB和人血清白蛋白均無交叉反應，說明各McAb是高度特異的;5株McAb均為IgG2a。

2.2 ELISA方法的建立 利用棋盤滴定的方法對包被抗體的濃度、血清稀釋倍數(shù)、標準曲線和酶標抗體的稀釋倍數(shù)進行了選擇。結果表明當包被抗體濃度為1∶800，酶標抗體濃度為1∶400，血清稀釋倍數(shù)為1∶200時曲線效果最佳。

2.3 標準工作曲線的建立 ApoA5-ELISA的標準曲線見圖1。ApoA5濃度在10.0～320.0 μg/L范圍內，曲線線性關系良好。本法測定的靈敏度為2.0 μg/L。

2.4 臨床應用 冠心病組TC、TG、LDL-C和ApoB水平明顯高于對照組(P<0.05)，而HDL-C、ApoA1和ApoA5水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。結果表明，ApoA5與HDL-C、ApoA1水平呈正相關(r值分別為0.53和0.63)，與TC、TG、 LDL-C、ApoB呈負相關(相關系數(shù)分別為 －0.69、－0.63和－0.69)。

圖1 ApoA5測定標準曲線

3 討論

研究表明，ApoA5基因多態(tài)性中少見等位基因與血清TG增加有關［3-7］。同時動物實驗和臨床研究證明ApoA5在體內TG代謝過程中發(fā)揮重要作用，敲除ApoA5基因小鼠的血漿TG水平約是正常對照的4倍，同時伴有極低密度脂蛋白(VLDL)的升高;相反，轉入人ApoA5基因的小鼠，其血漿TG水平下降66%，VLDL亦有下降;這些表明ApoA5表達與TG呈高度負相關［1，2］。因此，制備高效、特異的抗ApoA5單抗對于心血管疾病的診斷和治療具有良好的應用前景。

本研究利用ApoA5引物，擴增出ApoA5 cDNA的全長編碼序列和C端序列，將其連接到pQE30載體上，獲得了全長和片段His融合蛋白，純化復性后得到高純度的ApoA5蛋白。以它為抗原通過雜交瘤技術建立了雜交瘤細胞株，成功制備出了鼠源性的抗ApoA5的單抗。經特異性測定表明，單抗僅與純化的ApoA5反應，與其他抗原無交叉反應，表明抗ApoA5的單抗具有較高的特異性。

在抗體的制備過程中，我們發(fā)現(xiàn)有很多因素影響了單抗的效價和特異性。首先，人ApoA5與小鼠ApoA5具有高度的同源性，可達到70%以上，這就增加了制備ApoA5鼠源單抗的難度。因為蛋白的同源性越高，在生物體內產生有效免疫的可能性越低，從而不產生抗體或產生的抗體很少。其次，抗原的濃度也很關鍵。如果抗原濃度太低，動物也不會產生相應的抗體。我們就需要加大抗原濃度或增加免疫次數(shù)。另外，通過基因工程合成的抗原，雖然有效解決了由于天然蛋白含量少而不利于研究的問題，但是合成的抗原畢竟是在原核生物中產生的，其結構很可能與體內蛋白的結構不完全一致，從而不能高度有效的檢測人體內的ApoA5，達不到預期的理想效果。因此，關于抗ApoA5 McAb在臨床上的應用，將另文報道。

表1 2組血脂檢測結果比較±s

表1 2組血脂檢測結果比較±s

注:與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) ApoA1(g/L) ApoB(g/L) ApoA5(μg/L)正常對照組(n=145) 4.3±0.7 1.4±0.6 1.2±0.4 2.9±0.8 1.3±0.3 1.0±0.4 74±10冠心病組(n=68) 5.2±1.0* 1.8±0.8* 0.8±0.6* 3.8±0.9# 0.9±0.3# 1.8±0.8# 62±10*

在ApoA5 ELISA建立過程中，我們對實驗條件進行優(yōu)化，選擇包被抗體濃度為1∶800，酶標抗體濃度為1∶400，血清稀釋倍數(shù)為1∶200。標準曲線測量范圍10.0～320.0 μg/L，測定的靈敏度為2.0 μg/L。該方法初步應用于臨床，正常對照組和冠心病組血清ApoA5水平分別為(74±10)和(62±10)μg/L，冠心病患者的ApoA5水平明顯低于正常對照組(P<0.05)。通過ApoA5與脂質相關性研究發(fā)現(xiàn)，ApoA5與HDL-C、ApoA1組呈正相關，與TC、TG、LDL-C、ApoB呈負相關。表明ApoA5參與脂質代謝，對于高脂血癥有潛在的調節(jié)作用。

1 Vander Vliet HN，Sammels MG，Leegwater AJ，et al.Apolipoprotein A-V: a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration.J Biol Chem，2001，276:44512-44520.

2 Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing.Science，2001，294:169-173.

3 Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.Two independent Apolipoprotein A5 haplotypes influence human plasma triglyceride levels.Hum Mol Genet，2002，11:3031-3038.

4 Talmud PJ，Martin S，Taskinen MR，et al.APOAS gene variants，lipoprotein particle distribution，and progression of coronary heart disease:results from the LOCAT study.J Lipid Res，2004，45:750-756.

5 畢楠，鄢盛愷，李國平，等.冠心病患者載脂蛋白A5和載脂蛋白C3基因多態(tài)性的研究.中華心血管雜志，2005，33:116-121.

6 Austin MA，Talmud PJ，F(xiàn)arin FM，et al.Association of apolipoprotein A5 variants with LDL particle size and triglyceride in Japanese Americans. Biochim-Biophys-Acta，2004，1688:1-9.

7 Kao JT，Wen HC，Chien KL，et al.A novel genetic variant in the Apolipoprotein A5 gene is associated with hypertriglyceridemia.Hum Mol Genet，2003，12:2533-2539.

Preparation and characterization of monoclonal antibodies against human apolipoprotein A5 and its clinical application

JIAO Juan，ZHAO Mancang，WEI Wenqing，et al.Department of Central Laboratory，General Hospital of Beijing Military Command，Beijing100700，China

ObjectiveTo prepare the monoclonal antibodies against human apolipoprotein A5(ApoA5)，and to establish a double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay for the clinical detection of human ApoA5.MethodsThe BALB/c mice were immunized with recombinant ApoA5 to prepare the McAb.The antibody titers，specificity，subclass and antigenic determinants of the McAb were identified and measured.The serum ApoA5 levels of 145 healthy people and 68 patients with CHD were detected by ELISA.ResultsFive hybridoma cell lines secreting McAb against human ApoA5 were obtained，they were highly specific to ApoA5 and all belonged to the subtypes of IgG2a.The ascites titer reached 1.6×105.The levels TC，TG，LDL-C and ApoB in CHD group were significantly higher than those in control group(P<0.05)，however the levels of HDL-C，ApoA1 and ApoA5 in CHD group were significantly lower than those of control group(P<0.05).ConclusionThe APOA5 levels are positively related to HDL-C，ApoA1 levels，however，which are negatively correlated with TC，TG，LDL-C，ApoB levels.To explore the exact relationship between ApoA5 levels and hyperlipidemia may have potential clinical significance in prevention and treatment of cardiovascular diseases.

apolipoprotein A5;monoclonal antibodies;serum lipid;coronary heart disease

R 589.21

A

1002－7386(2010)03－0264－03

100700 北京市，中國人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院中心實驗科

趙滿倉，100700 中國人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院; E-mail:zhaomc456@163.com

2009－08－12)