湯訪評(píng)，趙宏波

（1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

全球大氣二氧化碳（CO2）正在以 1.5 μL·L－1·a－1的速率遞增，預(yù)計(jì)到 21世紀(jì)末，大氣二氧化碳將會(huì)增加到700 μL·L－1［1］。有關(guān)大氣二氧化碳體積分?jǐn)?shù)增高及其全球氣候變化，一直為全世界關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一［2－8］。春蘭Cymbidium goeringii是中國(guó)蘭花大家族中品種最豐富，觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均極高的一個(gè)種，也是繁殖最困難的種類之一。隨著前幾年春蘭野生資源遭毀滅性破壞，春蘭己瀕臨滅絕的邊緣。加快春蘭的繁殖，更好地保護(hù)國(guó)蘭資源，已成為當(dāng)前中國(guó)蘭花科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究選用春蘭的葉片為試驗(yàn)材料，通過(guò)設(shè)定人工氣候箱二氧化碳不同體積分?jǐn)?shù)，研究高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)對(duì)春蘭葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

春蘭培養(yǎng)基質(zhì)為陶粒（直徑3.0～6.0 mm），在121°C條件下滅菌20 min備用。培養(yǎng)容器是口徑為19 cm、高25 cm的蘭花泥盆。將滅菌過(guò)的基質(zhì)裝滿花盆，各花盆中栽含5株成熟蘭苗的蘭叢，15 d用1／2MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)液施肥1次［9］，平時(shí)用蒸餾水進(jìn)行澆灌，實(shí)行 “不干不澆，一次浸透”的原則。

本研究在二氧化碳人工氣候箱中進(jìn)行，一個(gè)氣候箱中的二氧化碳（所用二氧化碳為高純度氣體）體積分?jǐn)?shù)設(shè)定值為370 μL·L－1，培養(yǎng)箱中實(shí)際數(shù)值為 370±50 μL·L－1，作為對(duì)照，以模擬目前大氣中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)；另一個(gè)培養(yǎng)箱中的二氧化碳體積分?jǐn)?shù)設(shè)定值為700 μL·L－1，培養(yǎng)箱中實(shí)際數(shù)值為700±50 μL·L－1，以模擬 21世紀(jì)末大氣中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)。光照時(shí)數(shù)為 16 h·d－1，光強(qiáng)為 400 μmol·m－2·s－1，光期溫度為 26°C，相對(duì)濕度為 90%，黑暗時(shí)溫度為20℃，相對(duì)濕度大于90%。

研究從2009年4月開(kāi)始，處理2個(gè)月后，取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中新長(zhǎng)出的成熟葉作為檢測(cè)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉面積與葉厚度的測(cè)定 分別選取處理組和對(duì)照組春蘭各10株，取相同葉位的10片葉片在WDY-500A型葉面積測(cè)量?jī)x上測(cè)量各組葉片的葉面積。將葉片折疊成塊狀后投入盛有一定體積水的量筒中，用排水法［8］測(cè)葉片的體積。葉體積除以葉面積即為葉厚度。

1.2.2 葉綠體質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 取相同葉位葉片，稱量1.0 g鮮質(zhì)量葉片置于0.35 mol·L－1的氯化鈉等滲溶液中迅速搗碎（在0～5℃溫度下進(jìn)行）。將勻漿用 6層紗布過(guò)濾于燒杯中，取濾液在1 000 r·min－1下離心2 min，棄去沉淀。將上清液在3 000 r·min－1下離心5 min，棄去上清液，沉淀的即為葉綠體，稱量［9］。

1.2.3 氣孔密度和氣孔指數(shù)測(cè)定 取相同葉位的葉片，刮去上表皮和葉肉細(xì)胞，剩下下表皮，制成光鏡切片。每處理制5個(gè)，置于光學(xué)顯微鏡下，各選取4個(gè)視野進(jìn)行觀測(cè)計(jì)數(shù)，換算得氣孔密度（個(gè)·mm－2），單位面積的表皮細(xì)胞數(shù)與氣孔數(shù)之和即表皮細(xì)胞密度（個(gè)·mm－2），氣孔指數(shù) ＝（氣孔密度/表皮細(xì)胞密度）×100%［10］。用SPASS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面積與葉厚度變化

春蘭具假鱗莖，一株春蘭約5片葉子，各選取第3葉位的葉子進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示（表1）：春蘭在CO2體積分?jǐn)?shù)增加情況下，葉面積有了明顯的變化，對(duì)照的平均值為20.63 mm2，而處理組葉面積平均值為27.62 mm2，增大了33.88%，差異極顯著，主要表現(xiàn)在葉片寬度的變化，而長(zhǎng)度基本無(wú)變化。處理組葉片的厚度無(wú)顯著性變化。

表1 對(duì)照組與處理組春蘭葉片形態(tài)比較Table 1 Comparison with leaf morphology of Cymbidium goeringii of the control and the treated

2.2 葉綠體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

由表1結(jié)果可以看出，處理組春蘭葉片的葉綠體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為180.30 mg·g－1，增加了33.09%，差異極顯著，這說(shuō)明二氧化碳體積分?jǐn)?shù)增加促進(jìn)了葉綠體的形成。

2.3 表皮細(xì)胞密度變化

處理組春蘭葉片表皮細(xì)胞密度為1 561.29個(gè)·mm－2，比對(duì)照下降了9.72%，差異顯著（表1）。

2.4 氣孔密度與氣孔指數(shù)變化

結(jié)果顯示（表1），處理組春蘭葉片氣孔密度顯著下降，為139.82個(gè)·mm－2，與對(duì)照組相比下降了27.71%。同樣，隨著二氧化碳體積分?jǐn)?shù)的倍增，氣孔指數(shù)也處于下降趨勢(shì)，處理組和對(duì)照組之間差異極顯著。與對(duì)照相比，處理組春蘭氣孔密度下降比表皮細(xì)胞密度的下降幅度要大，可能是由于氣孔器的發(fā)生和發(fā)育受到高體積分?jǐn)?shù)二氧化碳抑制造成的。

2.5 氣孔形態(tài)變化

掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，處理組春蘭的氣孔器長(zhǎng)度發(fā)生了明顯的變化，對(duì)照組的氣孔呈圓形（圖1-A），而處理組的葉片氣孔呈長(zhǎng)橢圓形（圖1-B）。處理組氣孔開(kāi)度變小，使得細(xì)胞內(nèi)的水分散失減少，在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的水分增加，從而使細(xì)胞看起來(lái)較飽滿。

圖1 電鏡下春蘭葉片的氣孔形態(tài)（A對(duì)照組葉片氣孔；B處理組葉片氣孔）Figure 1 SEM stomatal morphology of Cymbidium goeringii leaf of the control（A）and the treated（B）

3 討論

迄今為止，已達(dá)60多種植物被用于進(jìn)行二氧化碳體積分?jǐn)?shù)增加的影響研究，其中包括30多種農(nóng)作物和近30種樹(shù)木和雜草［11］，但很少涉及到觀賞植物，春蘭對(duì)二氧化碳體積分?jǐn)?shù)升高響應(yīng)的研究未見(jiàn)報(bào)道。以往關(guān)于植物對(duì)大氣二氧化碳體積分?jǐn)?shù)變化的響應(yīng)，主要集中在植物光合與呼吸強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)器官各種生長(zhǎng)參數(shù)和結(jié)構(gòu)、水分利用效率、生物量與產(chǎn)量、植物化學(xué)成分以及主要酶系統(tǒng)含量等方面的影響［3－6］，對(duì)植物器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化則研究較少。如植物的光合器官——葉片，作為植物對(duì)環(huán)境條件變化較為敏感的營(yíng)養(yǎng)器官，其表型特征和生理生化特征的變化都能體現(xiàn)環(huán)境因子變化對(duì)它的影響或植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)［12－14］。

從多數(shù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在高體積分?jǐn)?shù)二氧化碳環(huán)境下，葉片的數(shù)量普遍增多、葉片增厚、葉面積增大［15］。本研究中，經(jīng)二氧化碳倍增處理2個(gè)月后，春蘭的葉片葉面積比對(duì)照極顯著增大，但春蘭葉片數(shù)量、厚度與長(zhǎng)度并沒(méi)有增大。這與前人的研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步研究。

在二氧化碳體積分?jǐn)?shù)倍增條件下，栽培植物表皮細(xì)胞密度和維管束鞘細(xì)胞中的葉綠體數(shù)明顯增加，野生植物則呈相反趨勢(shì)。魏氓等［13］觀察發(fā)現(xiàn)高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)處理下黃瓜Cucumis sativus葉片葉綠體的長(zhǎng)度和寬度分別比對(duì)照增加 8.36%和 26.49%。楊松濤等［14］的實(shí)驗(yàn)表明，在高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)下水稻Oryza sativa葉綠體內(nèi)的淀粉粒增加，葉綠體由原來(lái)的近梭形變成橢圓形或近圓形。該研究中，經(jīng)二氧化碳倍增處理后春蘭葉綠體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有極顯著提高，說(shuō)明高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)的升高有利于增強(qiáng)春蘭的光合作用。

在二氧化碳體積分?jǐn)?shù)升高對(duì)氣孔參數(shù)的影響方面，不同植物表現(xiàn)各不相同［15］。Woodward［3］通過(guò)比較不同年代的植物標(biāo)本和分析一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果后認(rèn)為，有60.00%的植物會(huì)因二氧化碳體積分?jǐn)?shù)升高氣孔密度下降。二氧化碳體積分?jǐn)?shù)升高可造成氣孔關(guān)閉，長(zhǎng)期處于高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)環(huán)境還會(huì)影響氣孔的發(fā)育。該研究發(fā)現(xiàn)，高體積分?jǐn)?shù)二氧化碳下春蘭氣孔密度下降，氣孔變狹長(zhǎng)，即氣孔開(kāi)度變小。氣孔密度減少和氣孔關(guān)閉的重要生理意義在于使植物的水分利用效應(yīng)發(fā)生改變，這種效應(yīng)越大，意味著植物光合速率越高［16］。而Murry［17］曾假設(shè)高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)引起的氣孔導(dǎo)度與水分利用率的變化是調(diào)節(jié)氣孔內(nèi)腔空間的結(jié)果，而非氣孔的多少引起的?？梢?jiàn)，對(duì)二氧化碳體積分?jǐn)?shù)升高影響氣孔的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育情況的研究應(yīng)與氣體交換的研究結(jié)合起來(lái)，才能正確理解高體積分?jǐn)?shù)二氧化碳對(duì)植物葉片氣孔的生理生化影響。

［1］LOWENSTEIN T K，DEMICCO R V.Elevated eocene atmospheric CO2and its subsequent decline［J］.Science，2006，313：19－28.

［2］張新時(shí)，高瓊，楊奠安，等.全球變化中國(guó)東北樣帶的剃度分析及其預(yù)測(cè)［J］.植物學(xué)報(bào)，1997，39（9）：785－799.ZHANG Xinshi，GAO Qiong，YANG Dian’an，et al.A gradient analysis and prediction on the Northeast China Transect（NECT）for global change study［J］.Acta Bot Sin，1997，39（9）：785－799.

［3］WOODWARD F I.Potential impacts of global elevated CO2concentrations on plants［J］.Curr Opin Plant Biol，2002，5：207－211.

［4］LONG S P，AINSWORTH E A，ROGERS A，et al.Rising atmospheric carbon dioxide：plants face the future［J］.Ann Rev Plant Biol，2004，55：591－628.

［5］LONG S P，AINSWORTH E A，LEAKEY A D B，et al.Food for thought：lower-than-expected crop yield stimulation with rising CO2concentrations［J］.Science，2006，312：1918－1921.

［6］K?RNER C.Plant CO2responses：an issue of definition，time and resource supply［J］.New Phytol，2006，172：393 －411.

［7］MURASHIGE T，SKOOG F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures［J］.Physiol Plant，1962，15：473-497.

［8］許守民，閻秀峰，梁秀英，等.應(yīng)用浮力法測(cè)定葉片厚度、密度及內(nèi)部空間體積［J］.植物生理學(xué)通訊，1989，25（5）：58－61.XU Shoumin，YAN Xiufeng，LIANG Xiuying et al.Application of buoyancy method for measuring leaf thickness，volume，density and internal gas volume［J］.Plant Physiol Commun，1989，25（5）：58－61.

［9］PRICE C A，CUSHMAN J C，MENDIOLA-MORGENTHALER LR，et al.Isolation of plastids in density gradients of percoll and other silica sols［M］//PACKER I，DOUCE R.Methods in Enzymology：148.San Diego：Academic Press，1987：157－179.

［10］RADOGLOU K M，JARVIS P G.The effects of CO2enrichment and nutrient supply on growth morphology and anatomy of Phaselous vularis L.seedings［J］.Ann Bot，1992，70：245－256.

［11］張昕，張秀芬，鞠賦紅.大氣CO2濃度升高對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響［J］.萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，14（1）：36-41.ZHANG Xin，ZHANG Xiufen，JU Fuhong.Effects of elevated CO2concentration on plant morphology and structure［J］.J Laiyang Agric Coll，1997，14（1）：36－41.

［12］謝永宏，于丹，耿顯華.CO2濃度升高對(duì)沉水植物菹草葉表型及生理生化特征的影響［J］.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，27（2）：218－222.XIE Yonghong，YU Dan，GENG Xianhua.Effects of elevated CO2concentration on phenotypic，physiological and biochemical characteristics of submersed plant Potamogeton crispus leaf［J］.Acta Phytoecol Sin，2003，27（2）：218－222.

［13］魏珉，邢禹賢，王秀峰，等.CO2加富對(duì)黃瓜葉片顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)的影響［J］.園藝學(xué)報(bào)，2002，29（1）：30－34.WEI Min，XING Yuxian，WANG Xiufeng，et al.Effects of CO2enrichment on the microstructure and ultrastructure of leaves in cucumber［J］.Acta Hortic Sin，2002，29（1）：30－34.

［14］左寶玉，姜桂珍，白克智，等.CO2濃度倍增對(duì)谷子和紫花首蓓葉綠體超微結(jié)構(gòu)的效應(yīng)［J］.植物學(xué)報(bào)，1996，38（1）：72－76.ZUO Baoyu，JIANG Guizhen，BAI Kezhi，et al.Effect of doubled CO2concentration on the ultrastructure of chloroplasts from Medicago sativa and Setari italica［J］.Acta Bot Sin，1996，38（1）：72－76.

［15］PRITEHARD S G，ROGERS H H，PRIOR S A，et al.Elevated CO2and plant structure：a review［J］.Global Change Biol，1999，5：807－837.

［16］蔣高明.全球大氣二氧化碳濃度升高對(duì)植物的影響［J］.植物學(xué)通報(bào)，1995，12（4）：1－7.JIANG Gaoming.The impact of global increasing of CO2on plants［J］.Chin Bull Bot，1995，12（4）：1－7.

［17］MURRAY D R.Plant responses to carbon dioxide［J］.Am J Bot，1995，82：690－697.