曾余力，林新春，桂仁意，張翠萍，黃麗春

（浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省現(xiàn)代森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300）

南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei屬國(guó)家一級(jí)瀕危保護(hù)植物之一，集材用、藥用、觀賞于一體，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。由于紅豆杉屬Taxus植物本身特殊的生物學(xué)特性，種子在天然條件下，需要兩冬一夏才能萌發(fā)并且植株生長(zhǎng)緩慢［1］，常規(guī)育種難以保證市場(chǎng)的需要，故通過(guò)離體胚培養(yǎng)技術(shù)克服紅豆杉種子難以萌發(fā)的缺點(diǎn)，以期加快植株生長(zhǎng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)短葉紅豆杉Taxus brevifolia，歐洲紅豆杉Taxus baccata，雜種紅豆杉Taxus×media var.hicksii，東北紅豆杉Taxus cuspidata等進(jìn)行了離體胚培養(yǎng)研究［2－3］，從不同角度證實(shí)離體胚的萌發(fā)、成苗與培養(yǎng)基、種子來(lái)源、培養(yǎng)條件等有密切關(guān)系，但對(duì)南方紅豆杉離體胚培養(yǎng)的研究較少，僅見(jiàn)臧新等［4－5］對(duì)南方紅豆杉離體胚萌發(fā)影響因素的研究。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上以南方紅豆杉的成熟胚為外植體，篩選外植體滅菌途徑，基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等因子對(duì)離體胚生長(zhǎng)和分化不定芽的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料購(gòu)自浙江省嵊州市常青花木場(chǎng)，于4℃冰箱中冷藏備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌 選取均勻飽滿的種子，剝?nèi)ネ夥N殼，流水沖洗12 h，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，分別置于 5.0，10.0，25.0 g·L－1的次氯酸鈉（NaClO）溶液中真空滅菌 5，10，15 min，無(wú)菌水分別沖洗 5遍。最后在解剖顯微鏡下切除胚乳挑取種胚，接入MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基中，1個(gè)種胚·管－1，各接種100管。接種后先暗培養(yǎng)2 d，然后再光培養(yǎng)。

1.2.2 不同基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響 試驗(yàn)一，挑取種胚分別接種于MS，1/2MS，1/3MS，1/4MS，WPM（woody plant medium）和 B5（Gamborg）等 6種基本培養(yǎng)基中，測(cè)試基本培養(yǎng)基的影響；試驗(yàn)二，以WPM為基本培養(yǎng)基，測(cè)試不同種類(lèi)和質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響：噻苯?。═DZ）為 0，0.000 1，0.001 0，0.010 0，0.100 0 mg·L－1，細(xì)胞激動(dòng)素（KT），6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），異戊烯基腺嘌呤（2iP）和玉米素（ZT）為 0，0.030 0，0.300 0，1.000 0，3.000 0，10.000 0 mg·L－1。

1.2.3 種胚萌動(dòng)對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響 根據(jù)種胚大小、顏色分別選取萌動(dòng)（長(zhǎng)度為0.7～0.8 cm，顏色轉(zhuǎn)微黃色）和未萌動(dòng)（長(zhǎng)度為0.4～0.5 cm，顏色白色）的種胚，測(cè)試不同發(fā)育時(shí)期對(duì)胚培養(yǎng)的影響。以WPM為基本培養(yǎng)基，附加 0，0.010 0，0.100 0，1.000 0 mg·L－1的 6-BA。以上試驗(yàn)培養(yǎng)條件：溫度為（25±2）℃，光照度為2 500～2 800 lx，光周期（晝/夜）16/8 h。對(duì)照組（ck）為WPM基本培養(yǎng)基。

1.2.4 馴化移栽 將帶根的試管苗置于馴化室中，在強(qiáng)光（2萬(wàn) lx）下練苗4周，然后取出試管苗，沖凈根部培養(yǎng)基，將植株移至泥炭 ∶珍珠巖 ∶蛭石為1∶1∶1的人工基質(zhì)中。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

以上各試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，各試驗(yàn)的結(jié)果分析均采用生物統(tǒng)計(jì)法將平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差［6］和95%的可信度進(jìn)行差異顯著性分析［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

培養(yǎng)28 d后調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)表1。最優(yōu)滅菌處理為25.0 g·L－1次氯酸鈉溶液真空滅菌10 min，其污染率僅6%，出苗率達(dá)86%。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨次氯酸鈉質(zhì)量濃度升高，污染率顯著降低，而滅菌時(shí)間加長(zhǎng)也能有效降低污染。由于南方紅豆杉胚乳較厚，高質(zhì)量濃度次氯酸鈉浸泡不會(huì)損傷到離體胚的萌發(fā)生長(zhǎng)，各處理的萌發(fā)率為93%～98%。

2.2 不同基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響

2.2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響 將南方紅豆杉離體種胚接于不同基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2個(gè)月后，MS培養(yǎng)基中的胚，葉色淡綠，莖較長(zhǎng)較粗，但根較短無(wú)側(cè)根，根長(zhǎng)約2.0 cm。在不同MS質(zhì)量濃度（1/3MS，1/2MS，MS）培養(yǎng)基的胚，隨無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度升高，芽長(zhǎng)增長(zhǎng)；在1/3MS中根長(zhǎng)最長(zhǎng)，根數(shù)最多?？赡苁悄戏郊t豆杉莖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)需要高質(zhì)量濃度的無(wú)機(jī)鹽離子，根生長(zhǎng)則以低質(zhì)量濃度無(wú)機(jī)鹽離子為宜，而莖葉和根的平衡生長(zhǎng)則需要大量元素的協(xié)調(diào)配比。對(duì)應(yīng)MS培養(yǎng)基，WPM培養(yǎng)基中離體胚莖段細(xì)長(zhǎng)，葉色深綠，并有許多側(cè)根生成，根系好，主根長(zhǎng)度達(dá)3.8 cm，平均根數(shù)達(dá)4.3條，是南方紅豆杉胚培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基；B5培養(yǎng)基由于莖細(xì)弱，葉色發(fā)黃，不適于南方紅豆杉的胚培養(yǎng)（圖1～3）。

2.2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響 將離體種胚接種于含有不同質(zhì)量濃度的6-BA的培養(yǎng)基中，50 d調(diào)查結(jié)果如表2。與對(duì)照組相比，6-BA質(zhì)量濃度遞增時(shí)，離體胚抽出莖葉的長(zhǎng)度遞降，胚根長(zhǎng)度變短甚至不萌發(fā)，胚軸上有突起發(fā)生。在6-BA 0.03 mg·L－1時(shí)，胚軸有突起形成，少數(shù)有不定芽分化；質(zhì)量濃度增加至0.10 mg·L－1，不定芽數(shù)量增加；但6-BA質(zhì)量濃度增高到1.00 mg·L－1時(shí)，突起變少，且突起不能分化為不定芽，并隨之褐化。將離體種胚接種于含有不同質(zhì)量濃度的KT

的培養(yǎng)基中，50 d調(diào)查結(jié)果如表3。由表3可知，0.10 mg·L－1KT的培養(yǎng)基中離體胚無(wú)莖葉抽出和胚根伸長(zhǎng)，但可見(jiàn)叢生不定芽的分化，誘導(dǎo)率達(dá)30%。與6-BA相比，KT更優(yōu)于不定芽的分化，但對(duì)莖葉和胚根生長(zhǎng)的抑制較明顯；當(dāng)KT質(zhì)量濃度升高至0.30 mg·L－1時(shí)不定芽的誘導(dǎo)率降低，而且隨KT質(zhì)量濃度的升高，對(duì)胚根發(fā)育的抑制越強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度提高至10.00 mg·L－1時(shí)，離體胚無(wú)生長(zhǎng)、褐化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種于含6-BA的培養(yǎng)基中的離體胚僅在胚軸上有突起產(chǎn)生，分化少量不定芽，而接種于含KT培養(yǎng)基中的離體胚在胚軸、子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)均有不定芽的分化。將離體種胚接種于含不同濃度ZT的培養(yǎng)基中，50 d調(diào)查結(jié)果如表4。由表4可知，ZT也能有效誘導(dǎo)不定芽的分化。當(dāng)ZT的質(zhì)量濃度在0.10～1.00 mg·L－1時(shí)，胚軸、生長(zhǎng)點(diǎn)和子葉均有不定芽分化，且多為叢生芽，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1時(shí)誘導(dǎo)率高達(dá)50%，與KT不同的是，ZT對(duì)莖葉抽出抑制不明顯，KT質(zhì)量濃度為0.10 mg·L－1時(shí)無(wú)莖葉抽出，而ZT的質(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1時(shí)仍有莖葉抽出，但節(jié)間較短，并且有輕微水化現(xiàn)象；當(dāng)ZT升至3.00 mg·L－1時(shí)，水化更為明顯。在含不同質(zhì)量濃度2ip的培養(yǎng)基中，2iP對(duì)不定芽的誘導(dǎo)較6-BA強(qiáng)（表5），對(duì)南方紅豆杉離體胚不定芽的誘導(dǎo)率最高，質(zhì)量濃度為0.30 mg·L－1時(shí)，誘導(dǎo)率高達(dá)70%，但僅有1～2個(gè)單芽·胚－1，而KT和ZT的不定芽多為叢芽。對(duì)莖葉抽出抑制效果低于6-BA，當(dāng)質(zhì)量濃度為3.00 mg·L－1莖葉仍有抽出，葉色較綠。添加TDZ的試驗(yàn)處理，都無(wú)不定芽分化。低質(zhì)量濃度TDZ中試管苗生長(zhǎng)與對(duì)照組相似，質(zhì)量濃度高于0.100 0 mg·L－1，胚軸膨脹，試管苗有水化現(xiàn)象；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.000 0 mg·L－1，種胚呈黃褐色愈合組織（表6）。

表1 種子表面滅菌對(duì)離體種胚培養(yǎng)的影響Table 1 Effect of factorial tests among various concentrations of NaClO vs.its durations on germination of excised embryos

圖1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)芽體生長(zhǎng)的影響Figure 1 Effects of basal media on shoot growth of Taxus chinensis var.mairei

圖2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)根數(shù)的影響Figure 2 Effects of basal media on root number of Taxus chinensis var.mairei

圖3 不同基本培養(yǎng)基對(duì)根長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響Figure 3 Effect of basal media on root growth of Taxus chinensis var.mairei

表2 6-BA對(duì)種胚培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽分化的影響Table 2 Effect of 6-BA on induction of adventitious buds by embryo culture

表3 KT對(duì)種胚培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽分化的影響Table 3 Effect of KT on induction of adventitious buds by embryo culture

表4 ZT對(duì)種胚培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽分化的影響Table 4 Effect of ZT on induction of adventitious buds by embryo culture

2.3 種胚萌動(dòng)對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響

由表7可知，將萌動(dòng)的種胚接種到含0.10～1.00 mg·L－16-BA的培養(yǎng)基上，離體胚分化出大量不定芽；而且隨6-BA質(zhì)量濃度增高，胚軸分化不定芽的數(shù)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；但是將未萌動(dòng)的種胚接種到相同的培養(yǎng)基中，僅在胚軸處產(chǎn)生突起，沒(méi)有不定芽的分化。

表5 2iP對(duì)種胚培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽分化的影響Table 5 Effect of 2iP on induction of adventitious buds by embryo culture

表6 TDZ對(duì)種胚培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽分化的影響Table 6 Effect of TDZ on induction of adventitious buds by embryo culture

表7 種胚萌動(dòng)前后對(duì)胚培養(yǎng)的影響Table 7 Effect of with or without breaking seed dormancy on germination of excised embryos

2.4 馴化移栽

將試管苗置于模擬自然環(huán)境中，經(jīng)1個(gè)月練苗馴化后，移至混合人工基質(zhì)中，成活率達(dá)到90%。

3 結(jié)論與討論

木本植物組織培養(yǎng)的困難之一是建立無(wú)菌材料。在建立無(wú)菌材料時(shí)，外植體表面滅菌將影響試驗(yàn)成敗。本研究采用25.0 g·L－1次氯酸鈉溶液真空滅菌10 min，污染率僅為6%，出苗率達(dá)86%。而且由于南方紅豆杉胚乳較厚，高質(zhì)量濃度的次氯酸鈉溶液不會(huì)傷害到內(nèi)部的胚，對(duì)其萌發(fā)無(wú)影響。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉種胚在MS培養(yǎng)基上能夠較好的萌發(fā)生長(zhǎng)，萌發(fā)率在95%左右，而陳永勤等［8］曾報(bào)道紅豆杉在MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)較差，這與本研究結(jié)果不一致。

臧新等［5］對(duì)MS和B5等培養(yǎng)基進(jìn)行研究，認(rèn)為這幾種培養(yǎng)基對(duì)南方紅豆杉的離體胚培養(yǎng)影響差別不大，而我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)不同基本培養(yǎng)基對(duì)離體胚培養(yǎng)影響較大。WPM培養(yǎng)基能促進(jìn)根系產(chǎn)生和莖葉生長(zhǎng)，是南方紅豆杉離體種胚培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基對(duì)南方紅豆杉莖段生長(zhǎng)亦較佳，但不利其根系的生長(zhǎng)。B5培養(yǎng)基也不適于南方紅豆杉的胚培養(yǎng)。

在不同細(xì)胞分裂素對(duì)離體種胚培養(yǎng)的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不加細(xì)胞分裂素時(shí)試管苗生長(zhǎng)最好，添加細(xì)胞分裂素不利于種胚的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，但可誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生且不需經(jīng)過(guò)愈合組織而直接分化產(chǎn)生不定芽，其中KT和ZT最適于南方紅豆杉的不定芽誘導(dǎo)。對(duì)于大多數(shù)樹(shù)種，誘導(dǎo)不定芽時(shí)，外植體需接種在細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配比的培養(yǎng)基中，但在許多針葉樹(shù)培養(yǎng)中，單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素，足以誘導(dǎo)不定芽發(fā)生［9－10］，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。

萌動(dòng)后的南方紅豆杉種子具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)和生理活性，而且此時(shí)內(nèi)源激素含量高于其他時(shí)期，而未萌動(dòng)的種子中發(fā)芽抑制物的含量較高［11］，抑制種子的萌發(fā)生長(zhǎng)。南方紅豆杉種胚萌動(dòng)對(duì)胚培養(yǎng)的影響，試驗(yàn)得知以萌動(dòng)后的種胚為外植體更容易誘導(dǎo)出不定芽，這可能與南方紅豆杉種胚內(nèi)源激素隨種胚成熟度而發(fā)生變化有關(guān)。

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