婁宏哲

我國現(xiàn)有1.3億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBS)感染者，定量檢測乙型肝炎病毒抗-HBs的滴度可對接種疫苗的效果進行評估，用于判定是否需要加強免疫，還可以評估普通人群免疫力。目前國內(nèi)抗定量分析有各種化學(xué)發(fā)光法和放射免疫分析，這些方法因儀器試劑昂貴或者需要使用放射元性素而無法普及應(yīng)用，時間分辨熒光免疫分析采用非放射免疫標記技術(shù)，能定量檢測乙型肝炎病毒標志物，是特異性及靈敏度均較高的一種新的檢測方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 檢測226例標本，為某單位職工注射疫苗1年后體檢抽取。空腹采靜脈血3 ml置促凝管內(nèi)，3500 r/min離心取血清備用。

1.2 方法與試劑 時間分辨采用中山達安基因股份有限公司膠體金方法采用廣州萬孚生物技術(shù)有限公司ELISA方法采用上海科華生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗原理 TRFIA法檢測采用雙抗原夾心分析法。用HBsAg包被反應(yīng)板，加入定標品或待測樣品，樣品中的抗-HBs與已包被的HBsAg結(jié)合成抗體-抗原復(fù)合物，再加入銪標記的 HBsAg，形成 HBsAg-抗-HBs-HBsAg-DTTA-Eu復(fù)合物。增強液將復(fù)合物上的Eu3+解離到溶液中，并與增強液中的有效成分形成高熒光強度的螯合物，其熒光強度與樣品中的抗-HBs濃度成正比。通過標準曲線得到樣本中抗-HBs的濃度。膠體金方法試劑條上以膠體金為標記包被重組乙肝表面抗原，應(yīng)用免疫層析原理檢測樣本中的抗-HBs?？?HBs采用雙抗原夾心法檢測標本中抗-HBs。

1.4 儀器 泰萊-Ⅰ型半自動時間分辨分析系統(tǒng)，F(xiàn)WI-ⅠMICRO-DSCILLATOR振蕩器，DEMⅢ型自動酶標洗板機，GDVDV990BV4酶標儀。

2 操作與結(jié)果

2.1 結(jié)果判定 TRFIA法定量檢測值＞10IU/L，判為陽性。ELISA法定性cut off(CO)為陰性對照孔OD均值N×2.1，樣品OD值S/CO≥1為抗-HBs陽性。膠體金法在檢測區(qū)(T)及對照區(qū)(C)各出現(xiàn)一條紅色反應(yīng)線為陽性。

2.2 結(jié)果比照

表1 TREIA法、ELISA法與GICA法檢測結(jié)果比照(例)

時間分辨的方法和ELISA與膠體金的方法陽性吻合率分別為98.6%和97.7%。

3 討論

目前測定抗-HBs的免疫學(xué)方法主要有ELISA、CLIA、ECLIA、RIA、膠體金免疫層析法(GICA)、斑點金免疫滲透法(DIGFA)、微粒子酶免疫分析(MEIA)、TRFIA 法等［1］。

醫(yī)學(xué)上研究乙肝和乙肝防治，特別是觀察療效，都需要定量的分析手段。時間分辨熒光分析(TRFIA)是以稀土離子標記抗原抗體、核酸探針和細胞等為特征的超靈敏度檢測技術(shù)，用生物素、酶等大分子標記物，須通過一系列化學(xué)反應(yīng)來檢測，其過程受影響因素較多，用原子直接標記，避免了各種不利因素的影響。它克服了酶標記物的不穩(wěn)定性、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光及一般熒光標記受環(huán)境干擾的難點，通過時間延遲和波長分辨，使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到了極高的性噪比，從而大大的超過了放射性同位素所能達到的測定靈敏度。

有資料表明，抗-HBs的含量在10 mIU/ml以上的人群并不代表機體都一定具有免疫力?？?HBs含量在10～100 mIU/ml之間的人群對HBV的免疫力弱，甚至不能預(yù)防HBV感染。只有抗-HBs的含量達到100 mIU/ml以上時，才有能力抵抗HBV的入侵;其含量越高，機體抵抗HBV入侵的能力越強［2］。同時，分析HBsAg和抗-HBs濃度的變化，可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。若HBsAg濃度降低，抗-HBs濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展。反之，HBsAg濃度處于較高水平或上升趨勢，而抗-HBs一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。德國終身預(yù)防接種委員會乙肝疫苗復(fù)種方案說明:抗-HBs在10～100 mIU/ml，每3～6個月復(fù)查1次;抗-HBs＞100 mIU/ml，10年后才需要加強一針;2.1～10.0 mIU/ml認為是對乙肝疫苗接種效果差;0.～2.1 mIU/ml認為是對乙肝疫苗接種無效果。有文獻報道9次注射乙肝疫苗仍檢測不到抗-HBs。對此有關(guān)專家曾進行不少觀察與研究，除增加接種次數(shù)提高陽性率外，接種劑量對抗-HBs的產(chǎn)生也呈正相關(guān)，有人用 20 μg ×3，30 μg-30 μg-10 μg，30 μg×3三種方法的免疫效果相同，與10 μg×3相比也有非常顯著性差異，另外也有報道，改變第二次與第三次注射的間隔時間可以提高免疫效果［3］。因此為了提高乙肝疫苗的免疫效果呢，除及時檢測抗-HBs采取補救措施外尚需要根據(jù)其他學(xué)者的改進措施進一步探索。

在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)操作時差不可避免的對結(jié)果有影響，在室溫(18℃ ～25℃)下手工加樣設(shè)備加完一塊板需時10 min而導(dǎo)致的弱陽性標本及高值陰性標本的檢測值結(jié)果的差異客觀存在，因此初試中對于高值陰性標本應(yīng)進行雙孔復(fù)試，且復(fù)試時應(yīng)保證加樣順序的優(yōu)先性。TRF操作過程中還應(yīng)注意TRF抗-HBs的銪標志物溶解后，易受環(huán)境中稀土元素污染而出現(xiàn)假陽性，需在1個月內(nèi)用完，否則測定結(jié)果將會受影響［4］。

酶聯(lián)免疫法的特點在于它的操作簡便，適用于大批量標本的檢測，且成本低廉，其靈敏度也很好，但無法定量，只能滿足臨床對單純陰、陽性結(jié)果的判定。對抗-HBs陽性結(jié)果是否具有保護意義無法提示。而且要注意其一些影響因素，如實驗室恒溫水箱、移液器、酶標儀之間的差異及操作人員手法間的區(qū)別等;甚至加完終止液到酶標儀讀測的時間長短也會造成結(jié)果的不一致。內(nèi)源性物質(zhì)(補體、AFP、RF、自身抗體)的干擾和外源性物質(zhì)(血液抗凝劑)、試劑盒質(zhì)量(特別是抗原包被的質(zhì)量)等均可影響ELISA檢測結(jié)果準確度，對其檢測的弱陽性標本應(yīng)復(fù)查，以減少誤報。

快速膠體金滲率檢測板檢測乙肝血清標志物漏檢的原因:①加樣量的不足或過多，可造成結(jié)果的誤判;②溫度影響:溫度過低，反應(yīng)速度降低，在規(guī)定時間內(nèi)弱陽性結(jié)果不能完全顯現(xiàn)出來，造成誤判;③快速膠體金滲率檢測板極易受潮導(dǎo)致結(jié)果誤判;④快速膠體金滲率檢測板檢測時水平位置的不同，影響血清擴散速度而造成結(jié)果誤判［5］。

通過以上分析，時間免疫分析法是近幾年迅速崛起的新方法，靈敏度高，標記物制備簡便，儲存時間長，無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點，成為繼放射免疫分析之后標記物發(fā)展的一個新的里程碑。

［1］魏來，陶其敏.努力規(guī)范肝臟疾病的免疫學(xué)診斷.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(2):69-70.

［2］喬艷紅，谷澤亮，張湔，趙京超.乙肝病毒表面抗體TRFIA方法的建立及其應(yīng)用.標記免疫分析與臨床，2005，3:24-26.

［3］林青.注射乙肝疫苗后不同階段的表面抗體濃度測定分析.湖南醫(yī)學(xué)，2006，17(2):130-131.

［4］王?？?，羅佳臻.兩種方法檢測低濃度乙型肝炎病毒表面抗體的探討.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4(6):485-487.

［5］李輝，卞文安.快速膠體金滲濾檢測板與ELISA法檢測乙肝血清標志物的對比分析.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，1(29):132-135.