喬立冬 邢臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)二科（054001）

銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因的研究

喬立冬 邢臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)二科（054001）

目的了解臨床分離的銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因的存在狀況，以便為臨床選擇用藥提供依據(jù)。方法自臨床分離的 95株銅綠假單胞菌，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)耐藥基因（TEM、SHV、OXA、PER、GES、IMP、VIM、DHA和 OprD2）結(jié)果95株銅綠假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)了7種耐藥基因，其中25%菌株檢測(cè)到兩種耐藥基因。結(jié)論銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的多重耐藥是由多種耐藥基因決定的。提示該菌具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制。

銅綠假單胞菌；耐藥基因；β-內(nèi)酰胺類抗生素

近年來，隨著抗生素的不斷開發(fā)和廣泛應(yīng)用，感染菌的菌群分布亦隨之發(fā)生變遷。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa），是醫(yī)院內(nèi)感染最常見的致病菌之一，引起的醫(yī)院內(nèi)感染在國(guó)內(nèi)約17.27%[1]，居第二位，國(guó)外報(bào)道10～31.5%[2]，居病原菌之首。近年來，P. aeruginosa耐藥性不斷增加，已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)3代頭孢菌素和亞胺培南耐藥的P. aeruginos菌，給臨床治療帶來極大困難。研究發(fā)現(xiàn)，P. aeruginos產(chǎn)生的各種β-內(nèi)酰胺酶（如 TEM、SHV、OXA、PER、VER、GES、CARB）、金屬β-內(nèi)酰胺（如IMP、VIM）和質(zhì)粒頭孢菌素酶（如DHA）以及外膜孔蛋白D2（OprD2）缺失，是對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要機(jī)制[3-8]。為了解我院臨床分離的 P. aeruginosa對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥原因，該文采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)了9種β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因（TEM、SHV、OXA、PER、GES、IMP、VIM、DHA和OprD2）報(bào)告如下：

1 材料和方法

液。置入-20℃冰箱備用。

1.4 基因檢測(cè)，均為PCR法各種靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為：每反應(yīng)體系P1、P2引物各 0.5μmol/L、kcl 10mmol/L(NH4)2SO48mmol/L、Mgcl 2mmol/L、Tris-Hcl (PH9.0)10mmol/L、NP400.5%、BAS 0.02%、TaqDNA pol 1μ?？偡磻?yīng)體積20μl（其中模板液5μl）。循環(huán)參數(shù)為：93℃，預(yù)變性2min，然后93℃ 6 0s→55℃，60s→72℃60s，循環(huán) 35周期，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽(yáng)性。耐藥基因檢測(cè)試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽(yáng)性對(duì)照DNA由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

Table 1 Primers of Target Genes and PCR Products

2 結(jié)果

2.1藥物敏感性試驗(yàn)，見表2?？梢娋陮?duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性均非常嚴(yán)重。

Table 2 Sensitivity of 95P.aeruginosas to 17 Antibiotics

2.2 基因PCR檢測(cè)95株P(guān). aeruginosa中，TEM、VIM、IMP、OXA、PER、GES，DHA陽(yáng)性率分別為：51.6%、40.1%、38.9%、32.4%、30.8%、30.3%、4.0%，而SHV、OprD2基因均陰性。

3 討論

1992年法國(guó)巴黎發(fā)現(xiàn)的TEM-42是在P. aeruginosa菌中第一個(gè)被報(bào)道的A類ESBLs[11].P. aeruginosa對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，提示該菌具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制。P.aeruginosa的主要耐藥機(jī)理是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，尤其是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，以及菌細(xì)胞外膜的通透性降低和菌體蛋白結(jié)構(gòu)與功能的變化。P. aeruginosa外膜脂多糖與磷脂之間，鮑林蛋白形成的孔道比一般革蘭陰性菌的孔道小，使多種抗革蘭氏陰性桿菌抗生素難以通過，是該菌對(duì)不同類別抗生素呈現(xiàn)出固有耐藥性的重要原因，這種固有耐藥性使P. aeruginosa成為臨床上難治致病菌之一，而主動(dòng)外排系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)更揭示了它是P. aeruginosa固有耐藥性或獲得性多重耐藥的更一重要原因[12]。P. aeruginosa的耐藥是由于產(chǎn)生滅活藥物的酶和（或）細(xì)菌外膜對(duì)藥物的通透性降低使抗菌藥物失效。由于β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用和碳青霉烯酶的產(chǎn)生，使其耐藥性明顯上升，因此在臨床上對(duì)抗生素使用進(jìn)行宏觀管理與控制成為目前減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要措施之一[13]。通過分析細(xì)菌的耐藥譜及耐藥模式，了解感染的發(fā)生發(fā)展趨勢(shì)，從而有計(jì)劃地交替使用敏感性強(qiáng)的抗生素，是提高臨床治療效率的必然選擇。

[1] 劉振聲,金大鵬,陳增輝.醫(yī)院感染管理學(xué).第一版.北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2000:363.

[2] 陳軍.銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)微生物學(xué)分冊(cè),2001,24(4):31.

[3] 糜祖煌.銅綠假單胞菌耐藥基因及其檢測(cè)[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2004,16(9):558-559.

[4] POIREL L, WELDHAGEN G F, DECHAMPS C, et al. A nosocomial outbreak of Pseudomonas aeruginosa isolates expressing the extended spetrum beta-lactamase GES-2 in South Africa [J]. Antimicrob Chemther，2002,49(3):561-565.

[5] SANSCHAGRIN F，BEJAOUI N，LEVESQUER C. Structure of CARB-4 and AER-1carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamases[J]. Antimicrob Agents Chemother ,1998,42(8):1966-1972.

[6] DECER D，ARLET G, BERGOGNE-Berezin E, et al. Identification of a carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamase in Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans. [J]. Antimicrob Agents Chemother，1995,39(3):771-774.

[7] SHIBATA N, DOL Y, YAMANE K, et al. PCR Typing of genetic determinants for metallo-β- lactamases and integrases carried by Gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron[J]. J Clin Microbiol, 2003,41(2):5407-5413.

[8] CASTANHEIRA M, TOLEMANM A, JONESR P, et al. Molecular characterization of aβ- lactamases gene, blagim-1, encoding a new subclass of metallo-β- lactamases[J]. Antimicrob Agents Chemother ,2004,48(12):4564-4661.

[9] 李仲興,鄭家齊.診斷細(xì)菌學(xué).黃河文化出版社,1992:386-390.

[10] 郭永建,戴以聰,周惠平.新生兒銅綠假單胞菌隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA 分子流行病學(xué)研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,1997,7(2):69-71.

[11] MUGNIER P, DUBROUS P, CASM I, et al. A TEM derived extended spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa [J]. Antimicrob Agents Chemother ,1996,40(11):2488-2493.

[12] Nikaide H.Outer membrane barrier, as a mechanism of antimicrobial resistance.Antimicrob,Agents Chemother,1999,33(11):1831.

[13] 錢小毛,趙仲農(nóng),王亞玲.紹興地區(qū)銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥機(jī)制研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2005,15(7):815-817.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.24.165

1672-2779（2010）-24-0200-02

2010-09-30）