楊惠祥 喬寶民 王廣有 李勝芝 張 玥 李長(zhǎng)平 徐 勇 馬騰驤

豬是異種移植器官供體的首選動(dòng)物，將人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因包括人衰變加速因子（human decay accelerating factor，hDAF）基因轉(zhuǎn)移到豬體內(nèi)是克服超急排斥反應(yīng)的有效方法[1]。目前常用受精卵顯微注射法培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但存在設(shè)備昂貴、技術(shù)復(fù)雜、效率低等缺陷。應(yīng)用精子載體法（SMGT）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法簡(jiǎn)便，成本低，便于規(guī)模生產(chǎn)[2]。由于SMGT轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)性較強(qiáng)，其轉(zhuǎn)染效率的穩(wěn)定性還有待提高。近年來(lái)，在基因治療領(lǐng)域，利用新型納米材料聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物PAMAM－D進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移獲得了成功[3]。本文嘗試將PAMAM-D/hDAF復(fù)合物與豬精子共孵育，以提高外源基因hDAF對(duì)豬精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）hDAF基因重組質(zhì)粒（以hDAF cDNA表示）由天津市泌尿外科研究所構(gòu)建完成[4]，抽提純化后加入內(nèi)切酶SacⅠ使其線(xiàn)性化，末端為黏性末端，工作液濃度為100 mg/L。（2）豬精液采自天津天泰公司豬場(chǎng)1～1.5歲的長(zhǎng)白雜交種豬，利用手握法采集含精子豐富的精液部分，距離實(shí)驗(yàn)時(shí)間不超過(guò)3 h，精液按照1∶10的比例稀釋于37℃預(yù)熱的豬授精培養(yǎng)基/牛血清白蛋白（SFM/BSA）液中，保存于17℃。（3）主要試劑：PAMAM-D（G5）由南開(kāi)大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孔德領(lǐng)教授惠贈(zèng)，SFM和SFM/BSA液的制備見(jiàn)參考文獻(xiàn)[2]（試劑均為Sigma公司產(chǎn)品），DNA探針/原位雜交檢測(cè)試劑盒（生物素標(biāo)記探針，北京鼎國(guó)公司），DNaseⅠ和限制性?xún)?nèi)切酶 SacⅠ、XbaⅠ、ClaⅠ(大連寶生物公司)。3′尾段標(biāo)記生物素的寡核苷酸DNA探針，序列為5′-GATTTTCCTCTGCATTCAGGTGGTG GGC-3′，由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PAMAM-D/DNA復(fù)合物的制備 100 μL SFM液中分別加入線(xiàn)狀 hDAF cDNA 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg，每組 cDNA再按氮磷比 10∶1、20∶1、40∶1 分別加入相應(yīng)劑量 PAMAM-D及不加PAMAM-D，輕輕混合后室溫下孵育30 min，形成的各組復(fù)合物以G5/hDAF表示。

1.2.2 G5/hDAF中DNA對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶的抗性分析 取G5/hDAF（氮磷比 10∶1）和 hDAF cDNA 各 1 μg，分別以 XbaⅠ/ClaⅠ雙酶切，2 h后煮沸停止反應(yīng)，加入十二烷基硫酸鈉（SDS，終濃度為0.4 mol/L）。另取1 μg G5/hDAF復(fù)合物（氮磷比10∶1），先加 SDS溶解（終濃度為0.4 mol/L），然后用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ/ClaⅠ消化。將消化物在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.3 豬精子細(xì)胞對(duì)外源性DNA的攝取 檢測(cè)豬精液密度與活力后，室溫下離心（3 500 r/min，10 min，下同），棄上清。加入SFM/BSA液洗滌精液2次后，SFM液洗滌1次，調(diào)整精子細(xì)胞密度為107/mL。取100 μL精子細(xì)胞懸液置于離心管中，分別加入上述各組G5/hDAF，17℃孵育2 h，對(duì)照組只加入相應(yīng)劑量的hDAFcDNA。每管設(shè)3個(gè)重復(fù)。PBS清洗3次后，保留約100 μL液體，吹打混勻。加入DNaseⅠ至終濃度為100 mg/L，37℃下作用30 min。PBS洗滌3次。保留約100 μL液體。

1.2.4 原位雜交檢測(cè)hDAFcDNA對(duì)豬精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 按照DNA探針/原位雜交檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。高倍鏡下讀片，每片隨機(jī)抽取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)400個(gè)精子細(xì)胞，記錄染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染率（轉(zhuǎn)染率=染色陽(yáng)性精子細(xì)胞數(shù)/400×100%）。在原位雜交流程中設(shè)定陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為人精子細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 G5/hDAF的抗酶切反應(yīng) 酶切后的G5/hDAF在電泳孔中不遷移，而經(jīng)SDS處理后可以遷移。復(fù)合物中的DNA分子不被限制性?xún)?nèi)切酶降解，見(jiàn)圖1。

圖1 PAMAM-D/DNA復(fù)合物的酶切電泳

2.2 hDAF cDNA對(duì)豬精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 在豬精子細(xì)胞頭部，特別是頂體后區(qū)可見(jiàn)黑色顆粒狀物，見(jiàn)圖2。兩因素析因設(shè)計(jì)定量資料的方差分析結(jié)果表明，不同劑量DNA、不同氮磷比之間轉(zhuǎn)染率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），且兩者之間的交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），0.4 μg DNA含量、氮磷比20∶1時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高，見(jiàn)表1。

圖2 豬精子細(xì)胞原位雜交檢測(cè)hDAF（BCIP/NBT染色×100）

表1 不同DNA量、不同氮磷比情況下精子細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 （n＝3，%，±s）

表1 不同DNA量、不同氮磷比情況下精子細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 （n＝3，%，±s）

F 組間=16 987.70，F(xiàn) 組內(nèi)=6 367.42，F(xiàn) 交互=404.10，均 P＜0.01

DNA量（μg）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0氮磷比0 10.4±0.2 28.5±0.2 29.6±0.2 20.3±0.3 22.0±1.0 10∶1 15.2±0.2 40.3±0.1 40.2±0.2 26.4±0.1 22.3±0.1 20∶1 16.3±0.2 47.5±0.2 44.3±0.2 35.5±0.3 24.5±0.1 40∶1 17.4±0.2 46.5±0.5 45.5±0.3 38.6±0.2 29.5±0.2

3 討論

精子載體法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵步驟是精子細(xì)胞高效穩(wěn)定地?cái)z取外源基因，進(jìn)而通過(guò)受精過(guò)程使外源基因成為胚胎細(xì)胞染色體的組成部分，從而培育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。成熟的動(dòng)物精子在結(jié)構(gòu)與功能上具有結(jié)合外源DNA并使其核內(nèi)化的能力，但外源基因與精子的結(jié)合是隨機(jī)發(fā)生的，穩(wěn)定性較差。為此，出現(xiàn)了多種試圖促進(jìn)外源DNA與精子結(jié)合的技術(shù)，包括電穿孔法、病毒介導(dǎo)和脂質(zhì)體法等[5]。這些改進(jìn)方法因存在種種缺點(diǎn)，如對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用、受精率下降及應(yīng)用的局限性等，而使精子載體法存在的問(wèn)題仍然難以得到根本改觀。

PAMAM-D是一種人工合成的新型納米材料，具有成輻射狀對(duì)稱(chēng)的剛性球體結(jié)構(gòu)。與普通高分子聚合物不同，它具有低黏度、高溶解性、可混合性以及高反應(yīng)性等特點(diǎn)，已成為基因轉(zhuǎn)移的一個(gè)新載體，較傳統(tǒng)載體有明顯優(yōu)勢(shì)。PAMAM-D在基因治療方面的研究很多，且取得了較好的效果[6]。但采用以PAMAM-D介導(dǎo)的精子載體法只見(jiàn)于培育魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究[7]。筆者將之應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因操作上是一種新的嘗試。

本研究表明，PAMAM-D分子能阻止PAMAMD/DNA復(fù)合物中DNA的電泳遷移，而陰離子去污劑SDS可以通過(guò)解離PAMAM-D/DNA復(fù)合物使得DNA分子釋放出來(lái)，證明PAMAM-D與DNA之間是通過(guò)靜電相互作用發(fā)生復(fù)合的。同時(shí)，存在于復(fù)合物中的DNA分子不受限制性?xún)?nèi)切酶的降解，因此推測(cè)，這些復(fù)合物在活體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)可能對(duì)各種酶類(lèi)降解有一定的抵抗作用，能夠維持外源性DNA的長(zhǎng)期存在，有助于外源基因與精子細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合，從而保持轉(zhuǎn)基因效率的穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入外源質(zhì)粒的數(shù)量直接影響轉(zhuǎn)染的效率。在0.2 μg組，由于DNA劑量較少使得轉(zhuǎn)染入精子中的外源基因比例低，在0.8 μg和1.0 μg組精子中的hDAF比0.4 μg和0.6 μg組均低，可能是較高劑量的外源DNA會(huì)抑制精子運(yùn)動(dòng)，并引發(fā)核酸內(nèi)切酶活性使之降解。本實(shí)驗(yàn)確定hDAF基因?qū)ωi精子轉(zhuǎn)染的最佳用量是 4～6 μg/107，氮磷比20∶1。

PAMAM-D沒(méi)有免疫原性，不引起機(jī)體免疫反應(yīng)，無(wú)遺傳毒性與細(xì)胞毒性，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與死亡。聯(lián)合應(yīng)用PAMAM-D可望增強(qiáng)SMGT的實(shí)用性，為下一步生產(chǎn)異種移植用轉(zhuǎn)基因豬提供一種新的轉(zhuǎn)基因方法。

[1]Ghanekar A,Lajoie G,Luo Y,et al.Improvement in rejection of human decay accelerating factor transgenic pig-to-primate renal xenografts with administration of rabbit antithymocyte serum[J].Transplantation，2002,74(1):28-35.

[2]Lavitrano M,Bacci ML,Forni M,et al.Efficient production by sperm--mediated gene transfer of human decay accelerating factor(hDAF)transgenic pigs for xenotransplantation[J].PNAS,2002,99(22):14230-14235.

[3]Teixeira LA,Fricke CH,Bonorino CB,et al.An efficient genetransfer system for hematopoietic cell line using transient and stable vectors[J].J Biotechnology,2001,88(2):159-165.

[4]劉秉乾，馬志方，李勝芝，等.異種移植轉(zhuǎn)基因用含雜合增強(qiáng)子UI的人衰變加速因子重組基因的構(gòu)建[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，11(4)：528-530.

[5]楊惠祥，徐勇，王廣有，等.精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)展與爭(zhēng)論[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版)，2006，27(10)：62-64.

[6]Teixeira LA,Fricke CH,Bonorino CB,et al.An efficient genetransfer system for hematopoietic cell line using transient and stable vectors[J].J Biotechnol,2001,88(2):159-165.

[7]楊凱,程漢華,郭一清,等.采用高分子介導(dǎo)精子作載體制備轉(zhuǎn)基因泥鰍[J].遺傳學(xué)報(bào),2001,28(12)：1137-1141.