王麗梅,郝艷秋,石麗宏

膽紅素腦病是游離膽紅素通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞中毒變性,出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)[1]。膽紅素腦病時(shí),一些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)代謝紊亂,產(chǎn)生肌張力改變及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙等一系列臨床癥狀,是導(dǎo)致小兒腦性癱瘓的原因之一,可造成手足徐動(dòng)型腦癱,視聽障礙、智力障礙等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。本研究通過監(jiān)測(cè)亞低溫治療不同時(shí)間窗內(nèi)膽紅素腦病仔兔腦基底節(jié)中DA、5-HT含量變化,探討局部亞低溫對(duì)膽紅素腦病的神經(jīng)治療及保護(hù)作用,為臨床新生兒膽紅素腦病亞低溫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用純系新西蘭仔兔112只,兔齡2～5 d,體重60～ 100 g,自然分娩,雌雄不拘,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將仔兔隨機(jī)分為4組:常溫對(duì)照組(NC):肛溫=37℃,n=28;亞低溫對(duì)照組(HC):肛溫 =33.5℃,n=28;常溫膽紅素腦病組(NB):肛溫=37℃,n=28;亞低溫膽紅素腦病組(HB):肛溫=33.5℃,n=28。4組仔兔又隨機(jī)分為0、6 h 、12 h 、24 h 組,每組各 7 只 。

1.1.2 試劑與儀器 膽紅素(C33H36N4O6,分子量584.7):美國Sigma公司;DA、5-HT測(cè)試盒;二乙酸熒光素及國產(chǎn)分析純或化學(xué)純等。儀器有HDB-01貼敷式局部亞低溫腦保護(hù)儀:哈爾濱工業(yè)大學(xué)熱工教研室研制;SL24型針型點(diǎn)溫傳感器(?=1.15 mm);熒光分光光度計(jì);高效液相色譜儀等。

1.2 方法

1.2.1 造模 向NB組和HB組仔兔腹腔注射膽紅素200 μ g/g,NC組和HC組腹腔注射生理鹽水1 ml。給藥后恒溫、恒濕、避光環(huán)境中配方乳哺育4 h。仔細(xì)觀察仔兔神經(jīng)行為變化。

1.2.2 亞低溫治療 HB和HC組于造模結(jié)束后立即應(yīng)用HDB-01貼敷式局部亞低溫腦保護(hù)儀治療,降溫帽置于仔兔頭部,三維靶點(diǎn)降溫,設(shè)定制冷溫度為8℃,腦內(nèi)制冷溫度33.0℃[3],腦溫過低采用60 W白熾燈加熱,過高用冰袋降溫,亞低溫時(shí)間分別為0、6 h、12 h、24 h。停止降溫后自然復(fù)溫。觀察治療期間仔兔的一般狀態(tài)。

1.2.3 取材 于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將仔兔用10%水合氯醛0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉,經(jīng)左心室插管入主動(dòng)脈,生理鹽水200 ml灌注,4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2;4℃)100 ml灌注固定。仔兔斷頭,冰盤下取出腦組織,剝離腦膜及大血管,以冷生理鹽水沖洗數(shù)次,自腦組織矢狀縫切開,一側(cè)立即于-20℃凍存,用于測(cè)定腦基底節(jié)區(qū)DA、5-HT及膽紅素含量。

1.3 5 -H T、DA及膽紅素測(cè)定 腦基底節(jié)區(qū)組織勻漿,按試劑盒說明操作,采用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)光波長365 nm、發(fā)射波長480 nm下測(cè)樣品熒光強(qiáng)度,測(cè)定5-HT含量,在波長310/370 nm下測(cè)DA含量。膽紅素采用重氮檢測(cè)法:10倍體積冰醋酸勻漿,1500 r/min離心5 min,取上清液,再加等體積丙酮混勻,抽提、離心取上清液。各管分別加入重氮試劑,5 min后于波長540 nm下讀取吸光度。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為觀察 NC和HC組仔兔于麻醉蘇醒后活動(dòng)正常,吸吮有力,無異常神經(jīng)行為活動(dòng),對(duì)外界刺激有靈敏的逃避反應(yīng)。NB組仔兔造模結(jié)束后表現(xiàn)為興奮、躁動(dòng)和易激惹;6 h后出現(xiàn)俯伏,運(yùn)動(dòng)減少,對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍,動(dòng)作遲緩,平衡差,轉(zhuǎn)圈,翻滾;12 h出現(xiàn)角弓反張,顫動(dòng),抽搐,不能步行;24 h出現(xiàn)四肢不能活動(dòng);2例死亡。HB組在亞低溫治療后12 h出現(xiàn)俯伏,運(yùn)動(dòng)減少,對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍,動(dòng)作遲緩,平衡差,轉(zhuǎn)圈,翻滾;24 h對(duì)刺激反應(yīng)較前靈敏,運(yùn)動(dòng)增加;未出現(xiàn)角弓反張,顫動(dòng),抽搐及不能步行;無死亡。

2.2 DA及5-HT變化 NB和HB組仔兔腦基底節(jié)中DA及5-HT含量于造模結(jié)束后與NC及HC組比較均明顯降低(P＜0.01),兩組間相比無顯著性差異(P＞0.05)。HB組于治療6 h、12 h、24 h時(shí)DA及5-HT含量與NB組比較均明顯升高(P＜0.01),于24 h接近正常。見表 1、表2。

表1 不同時(shí)間仔兔腦基底節(jié)中DA含量(nmol/g)

2.3 膽紅素變化 NB及HB組仔兔腦基底節(jié)中膽紅素于造模結(jié)束后與NC及HC組比較均明顯增高(P＜0.01),兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。HB組經(jīng)亞低溫治療6 h、12 h、24 h后,膽紅素含量明顯降低(P＜0.01)。見表3。

NB組腦組織中膽紅素含量與DA含量高度負(fù)相關(guān)(r=-0.99,P＜0.01)。

表2 不同時(shí)間仔兔腦基底節(jié)中5-HT含量(nmol/g)

表3 不同時(shí)間仔兔腦基底節(jié)中膽紅素含量(μ g/g)

3 討論

近年來國內(nèi)外一些研究證明,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂在膽紅素腦病神經(jīng)元損傷,尤其是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中起重要作用[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化處于相對(duì)平衡狀態(tài),膽紅素的神經(jīng)毒性可以打破這種平衡狀態(tài)。

Grojeans等發(fā)現(xiàn),膽紅素腦病時(shí),游離膽紅素使線粒體功能受損[5],細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),產(chǎn)生過多的氧自由基[6];氧自由基可隨腦血流進(jìn)入基底核區(qū),對(duì)多巴胺及非多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,在此基礎(chǔ)上激活小膠質(zhì)細(xì)胞、啟動(dòng)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏,最終引起進(jìn)行性神經(jīng)元變性死亡,造成多巴胺能神經(jīng)元受損死亡[7]。而在殘存的多巴胺能神經(jīng)元中,因代償作用使多巴胺的合成、代謝和更新的速率都加快,產(chǎn)生更多的氧自由基進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激,增加多巴胺能神經(jīng)元的損傷。當(dāng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性超過80%時(shí),就會(huì)出現(xiàn)錐體外系的失調(diào),失去對(duì)運(yùn)動(dòng)的自控能力[4]。

另外,中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著5-HT能神經(jīng)元。膽紅素腦病時(shí),腦干中縫核5-HT神經(jīng)元變性、脫失,導(dǎo)致紋狀體中5-HT減少及5-HT-組織胺系統(tǒng)失衡,使組織胺興奮作用增強(qiáng)而產(chǎn)生臨床癥狀,也表現(xiàn)為錐體外系癥狀。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),亞低溫在海馬、腦皮質(zhì)、基底節(jié)、丘腦等處具有明顯神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[3]。近年來大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明,缺氧缺血后6 h內(nèi)給予持續(xù)72 h的亞低溫治療,神經(jīng)保護(hù)作用顯著[8]。亞低溫治療有全身亞低溫及局部亞低溫,由于兒科尤其是新生兒涉及保溫,所以多選擇局部亞低溫。目前亞低溫治療新生兒疾病尚處于早期臨床研究階段。周文浩等對(duì)24例中重度窒息足月新生兒進(jìn)行頭部亞低溫治療并對(duì)其安全性評(píng)價(jià),證實(shí)亞低溫治療將體溫維持在34.5℃左右,不會(huì)加重窒息新生兒心、肝、腎及血液、代謝等功能損害。本研究采用貼敷式局部亞低溫治療儀,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)硬腫、呼吸暫停等,動(dòng)物吸吮能力及進(jìn)奶量在各組間未見明顯的差別,各組仔兔體重降低也不明顯,從而也證明亞低溫治療的安全性。

文香淑等對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在膽紅素腦病動(dòng)物體內(nèi)的含量變化進(jìn)行研究,證明膽紅素腦病時(shí),基底神經(jīng)核區(qū)DA、5-HT含量下降,海馬、腦干、皮層均有輕度降低,腦干區(qū)NE下降,海馬、皮層、基底核NE均有下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;基底核DA、5-HT含量與腦干NE含量呈線性正相關(guān),基底節(jié)區(qū)DA含量與5-HT含量線性正相關(guān),表明膽紅素神經(jīng)毒性可使基底節(jié)區(qū)DA、5-H T能神經(jīng)元與腦干NE能神經(jīng)元同時(shí)受到破壞,影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放與攝取[9]。與本研究結(jié)論相似。本研究結(jié)果還顯示,未經(jīng)治療的膽紅素腦病腦組織內(nèi)膽紅素逐漸升高,并與腦組織DA負(fù)相關(guān);表現(xiàn)為膽紅素濃度依賴性和作用時(shí)間依賴性[10]。這也為神經(jīng)行為學(xué)變化所證實(shí)。

本研究顯示,貼敷式局部亞低溫可以減輕膽紅素對(duì)腦組織的神經(jīng)毒性,減輕腦組織尤其是基底神經(jīng)核區(qū)DA、5-H T能神經(jīng)元的損傷,對(duì)腦組織具有保護(hù)作用,并可改善仔兔的神經(jīng)行為異常。亞低溫時(shí)間越長,效果越好。

目前認(rèn)為,亞低溫治療時(shí)間越早預(yù)后越好,一般主張?jiān)诎l(fā)病后6 h內(nèi)使用;使用亞低溫治療時(shí)間可根據(jù)病情維持2～5 d,一般主張不超過7 d。但國內(nèi)也有報(bào)道因病情嚴(yán)重可應(yīng)用14 d[8]。

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