張 敏,趙旌旌,武文斌,趙 赟,朱興磊,瞿偉菁

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062

杜香不同提取部位的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究

張 敏,趙旌旌,武文斌,趙 赟,朱興磊,瞿偉菁＊

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062

采用小鼠醋酸扭體法和角叉菜膠致小鼠足掌腫脹模型篩選杜香三種提取部位鎮(zhèn)痛抗炎作用。結(jié)果顯示,甲醇提取物 (10.0、1.0 mg/kg)和水提物 (10.0 mg/kg)能顯著抑制醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)和角叉菜膠引起的小鼠足趾水腫。水提物 (10.0 mg/kg)在致炎后 2～4 h內(nèi)效果接近吲哚美辛。高效液相色譜結(jié)果提示甲醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎效果可能通過其所含黃酮類化合物實(shí)現(xiàn)。

杜香;提取;鎮(zhèn)痛;抗炎;黃酮

杜香 (Ledum palustreL.)系杜鵑花科杜香屬植物[1]。我國(guó)野生杜香資源豐富,主要分布在中國(guó)東北的長(zhǎng)白山和大小興安嶺等地區(qū),為我國(guó)北方蒙古族和朝鮮族傳統(tǒng)民藥,別名白山苔、喇叭茶[2,3]。枝、葉入藥[2],主治“活血調(diào)經(jīng);化痰止咳[4]?！倍畔銚]發(fā)油具有明顯的鎮(zhèn)咳、祛痰作用[3]。杜香嫩枝煎劑具有解痛、祛痰、脫敏等作用[5]。而杜香甲醇提取物功效未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)通過醋酸誘導(dǎo)小鼠扭體反應(yīng)模型和角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足趾腫脹模型比較杜香不同提取部位的急性鎮(zhèn)痛、抗炎作用。同時(shí),通過高效液相色譜法探討杜香甲醇提取物有效成分及其鎮(zhèn)痛抗炎機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

杜香 (Ledum palustreL.),采自吉林省安圖縣(吉林省白河林業(yè)局提供),經(jīng)本單位植物分類學(xué)研究室李宏慶副教授鑒定。

1.1.2 藥品

吲哚美辛(上海新帕斯制藥有限公司);λ-角叉菜膠 (λ-carrageenan,Sigma Co.);蘆丁 (rutin,上海恒信化學(xué)試劑公司);槲皮素(quercetin,上海恒信化學(xué)試劑公司);楊梅素 (myricetin,Sigma Co.);山柰酚(kaemferol,Sigma Co.);異鼠李素 (isorhamnetin,中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇:色譜純;其他試劑均為分析純。

1.1.3 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn) ICR小鼠體重 20～22 g(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,滬動(dòng)合證字 153號(hào))。

1.1.4 儀器

高效液相色譜儀 (Agilent 1100 series);Kromasil C18液相色譜柱 (250×4.6 mm,5μm);電子天平(SartoriusBP-211D);游標(biāo)卡尺 (精度 0.02 mm)。

1.2 方法

1.2.1 杜香各化學(xué)部位提取

杜香枝葉采摘后置于陰涼處風(fēng)干,200 g材料粉碎為粗粉,水蒸氣法蒸餾 4 h后收集精油;回收杜香材料,常溫下?lián)]干,石油醚 70℃脫脂 2次,每次 2 h;脫脂后材料常溫下?lián)]干,分別用 1 L甲醇 70℃回流提取 3次,每次 2 h,合并提取液;再次將材料于常溫下?lián)]干,分別用 1 L蒸餾水 95℃回流提取 3次,每次 2 h,合并提取液。抽真空濃縮,將提取物冷凍干燥,-4℃低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 杜香提取物對(duì)醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)的影響

參照 Koster法[6],略作改動(dòng):取健康小鼠 96只,雌雄各半,體重 20～25 g,隨機(jī)分成 8組,每組 12只,實(shí)驗(yàn)前 12 h禁食。腹腔注射 (i.p.)待測(cè)藥物(精油 0.02,0.01 mg/kg;甲醇提取物 10.0,1.0 mg/ kg;水提物 10.0,1.0 mg/kg;v/v,10mL/kg體重);注射生理鹽水組作為空白對(duì)照;吲哚美辛組作為陽(yáng)性對(duì)照藥。30 min后腹腔注射 0.6%醋酸 (v/v,10 mL/kg體重),觀察給藥后 20 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù),并計(jì)算抑制率,抑制率 (%)=(生理鹽水組平均扭體次數(shù) -給藥組平均扭體次數(shù))/生理鹽水組平均扭體次數(shù) ×100%。

1.2.3 杜香提取物對(duì)λ-角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹的影響

參照W inter法[7],并略作改動(dòng):取健康雄性小鼠 96只,體重 20～25 g,隨機(jī)分為 8組,每組 12只,實(shí)驗(yàn)前 24 h禁食。腹腔注射待測(cè)藥物 (精油 0.02, 0.01 mg/kg;甲醇提取物 10.0,1.0 mg/kg;水提物10.0,1.0 mg/kg;v/v,10 mL/kg體重);注射生理鹽水組作為空白對(duì)照;吲哚美辛組作為陽(yáng)性對(duì)照藥[8]。30 min后從小鼠右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向進(jìn)針皮下注射 1%λ-角叉菜膠 (生理鹽水溶解)50 μL,其后分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量 1、2、3、4、5、6 h后小鼠足掌心至足背厚度。以致炎后不同時(shí)間的足掌厚度減去給藥前足掌厚度之差作為炎性腫脹度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以“mean±S.D.”表示,用 SPSS軟件進(jìn)行方差分析(One-WayANOVA)。

1.2.5 高效液相色譜法對(duì)杜香甲醇提取物定性分析

色譜條件:流動(dòng)相,甲醇/0.4%磷酸溶液 (60∶40),流速 1.0 mL/min,柱溫 20℃,進(jìn)樣體積 20μL,檢測(cè)波長(zhǎng) 368 nm。樣品液制備:用色譜純甲醇溶解甲醇提取物冷凍干粉配成 2%溶液,溶液用濾紙過濾,上柱前 10000轉(zhuǎn)離心 10 min。

2 結(jié)果

2.1 杜香提取物對(duì)醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)的影響

表 1結(jié)果表明:10.0 mg/kg杜香甲醇提取物, 10.0 mg/kg水提物及吲哚美辛均能極顯著 (P< 0.01)地減少醋酸腹腔注射所致小鼠扭體次數(shù),抑制率分別為 29.30%、53.50%及 72.5%。所有提取物中,10.0 mg/kg水提物止痛效果最佳,但不如陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛,與之相比有顯著差異(P<0.01)。

表 1 杜香提取物對(duì)醋酸誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)的鎮(zhèn)痛效果Table 1 Analagesic effect of the extracts of leaves ofLedum palustreon acetic acid-induced writhing response in mice

2.2 杜香提取物對(duì)λ-角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹的影響

表 2結(jié)果顯示:10.0、1.0 mg/kg杜香甲醇提取物,10.0 mg/kg水提物在λ-角叉菜膠注射后 2～6 h內(nèi),均能極顯著地 (P<0.01)抑制小鼠足趾腫脹。其中以 10.0 mg/kg水提物效果最強(qiáng),在致炎后2～4 h內(nèi),效果近似于吲哚美辛(與吲哚美辛組比較,P> 0.05)。1.0 mg/kg水提物在致炎后 3～6 h內(nèi)能極顯著地 (P<0.01)抑制小鼠足趾腫脹。此外,0.02 mg/kg精油在致炎后 3 h時(shí),0.01 mg/kg精油在致炎后 3～4 h內(nèi)也有一定的消腫作用 (P<0.05),但效果不持續(xù)。

表 2 杜香提取物對(duì)λ-角叉菜膠引起小鼠足趾腫脹的影響Table 2 Effect of the extracts of leaves ofLedum palustreon hind paw edema induced byλ– carrageenan in mice

2.3 高效液相色譜法對(duì)杜香甲醇提取物定性分析

結(jié)果如圖 1A所示:檢測(cè)波長(zhǎng) 368 nm下,5種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間 (min)分別為:蘆丁 3.480、楊梅素 4.634、槲皮素 7.005、山柰酚 11.269和異鼠李素12.106。

圖 1 高效液相色譜法對(duì)杜香甲醇提取物定性分析Fig.1 Quality analysisofmethanol extractsofLedum palustre by high performance liquid chromatography

圖 1B顯示:杜香甲醇提取物在同樣條件下,在保留時(shí)間為 3.605,4.718,7.002和 12.201 min處有吸收峰存在,且添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液后,顯示上述四個(gè)吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰有疊加(如圖 C所示),判斷樣品中存在蘆丁、楊梅素、槲皮素和山柰酚 4種黃酮。

用同樣方法將杜香水提物與標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC色譜圖比對(duì),并在杜香水提物中添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液后,獲得一個(gè)疊加峰,推測(cè)杜香水提物中可能含有槲皮素。

3 討論

藥用植物中黃酮類和萜類化合物的鎮(zhèn)痛、抗炎作用引人關(guān)注[9,10],其效果通過抑制炎癥過程中多種關(guān)鍵酶的活性實(shí)現(xiàn)[11],并與非甾醇類抗炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSA IDs)靶點(diǎn)類似。

杜香精油的主要組分是萜類化合物[3],具一定毒性[2],10.0,1.0 mg/kg精油 (i.p.)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)致死現(xiàn)象(結(jié)果未顯示)。0.02、0.01 mg/kg杜香精油 (i.p.)為安全劑量,但對(duì)小鼠扭體和小鼠足趾腫脹均無(wú)明顯藥效。杜香甲醇提取物能極顯著地抑制小鼠扭體反應(yīng)以及小鼠足趾水腫,其中黃酮類化合物含量達(dá) 29.3% ±8.5%(分光光度法測(cè)定[12],結(jié)果未顯示)。高效液相色譜結(jié)果顯示:杜香甲醇提取物中存在蘆丁、楊梅素、槲皮素和山柰酚 4種黃酮。這四種黃酮單體均見報(bào)道具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[11,13,14],提示:黃酮類化合物可能是杜香甲醇提取物鎮(zhèn)痛、抗炎的藥效部位。而通過標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),推斷杜香水提物中可能存在槲皮素。其他有效成分有待進(jìn)一步鑒定。

本實(shí)驗(yàn)采用的醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)是一種內(nèi)臟性疼痛模型[6],由 COX釋放花生四烯酸和前列腺素致痛[15]。陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛具有抑制 COX活性,減少前列腺素生成的作用[16]。杜香甲醇提取物、水提物鎮(zhèn)痛效果不及吲哚美辛,其作用靶點(diǎn)和作用量效關(guān)系尚待深入研究。

角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)是常用的急性炎癥模型。角叉菜膠注射會(huì)激發(fā)肝臟組織內(nèi)自由基積累、血管舒緩激肽 (bradykinin)釋放[17]以及血清COX含量增加[18]等多條途徑,促使前列腺素合成,前列腺素和其他內(nèi)分泌物積累是導(dǎo)致炎癥水腫的主要原因[19]。非甾醇類抗炎藥吲哚美辛對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的水腫藥效顯著[20]。在本實(shí)驗(yàn)中,杜香甲醇提取物和水提物均能顯著地抑制局部水腫,且作用效果持久,致炎后 2～6 h內(nèi)與對(duì)照組比較均有極顯著差異。1 mg/kg甲醇提取物在致炎后 3 h,10 mg/kg水提物在致炎后 2～4 h內(nèi)抑制效果接近吲哚美辛。

綜合以上結(jié)果,杜香甲醇提取物具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎效果。黃酮類化合物可能是杜香鎮(zhèn)痛、抗炎的主要藥效部位。而其效果是通過抑制 COX,還是影響前列腺素生成的其他環(huán)節(jié),則有待于進(jìn)一步研究。

1 Editorial Commission of China Flora of Chinese Academy of Sciences(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)).Flora of China(中國(guó)植物志),1ed.Beijing:Science Press,1997,57 (1):4-7.

2 Zhu Y M(朱亞明).Herbal Drugs Records of InnerMogolia (內(nèi)蒙古植物藥志 ).Huhhot:Inner Mogolia People’s Press,1989,2:523-524.

3 Nature ReserveBureau of ChangbeiMountain Research Institute of ChineseMedicine and Drug in Jilin Province,Department ofBiology inNortheastNor malUniversity(吉林省中醫(yī)藥研究所,長(zhǎng)白山自然保護(hù)局,東北師范大學(xué)生物系). HerbalDrugs Records on ChangbaiMountain(長(zhǎng)白山植物藥志),Changchun:Jilin People’s Press,1982:863.

4 Editorial Board of China Herbal(中華本草編委會(huì)),State Administration of TraditionalChineseMedicine(國(guó)家中醫(yī)藥管理局).China Herbal(中華本草).Shanghai:Shanghai Scientific and Technology Publishers,1998,16:5251-5252.

5 Ma XM(馬雪梅),Mao ZJ(毛子軍),Yang YF(楊永富),et al.A Summary on the exploitation and utilization of source plantLedum plastureL..J NE Fore Univ(東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)),2003,31(6):52-54.

6 Koster R,Anderson M,Beer EJ.Acetic acid for analgesic screening.Fed Proc,1959,18:412-416.

7 W inter CA,Risley EA,Nuss G W.Carragenin-indced oedema in hind paw on the rat as an assay for anti-inflammatory drugs.Proc Soc Exp B iolM ed,1962,111:544-547.

8 Mascolo N,Jain R,Jain SC,et al.Ethnophar macologic investigation of ginger(Zingiber officinale).J Ethnophar m acol, 1989,27(1-2):129-140.

9 NairMP,Mahajan S,Reynolds JL,et al.The flavonoid quercetin inhibits proinflammatory cytokine(tumor necrosis factor alpha)gene expression in nor mal peripheral blood mononuclear cells via modulation of the NF-kappa beta system. Clin Vaccine Imm unol,2006,13:319-328.

10 HerasBde L,Hortelano S.Molecular basis of the anti-inflammatory effects of terpenoids.Inflamm A llergy D rug Targets, 2009,8(1):28-39.

11 Kwon KH,Murakami A,Tanaka T,et al.Dietary rutin,but not its aglycone quercetin,ameliorates dextran sulfate sodium-induced exper imental colitis in mice:attenuation of proinflammatory gene expression.B iochem Phar macol,2005,69: 395-406.

12 Qu WJ(瞿偉菁),Zhang ZL(張志良).A Instruction of Plant Physiology Experiments(植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)),3ed. Beijing:Higer Education Press,2004.133-134

13 Morikawa K,NonakaM,NaraharaM,et al.Inhibitory effectof quercetin on carrageenan-induced inflammation in rats.Life Sciences,2003,74:709-721.

14 Garcia-Mediavilla V,Crespo I,Collado PS,et al.The anti-inflammatory flavones quercetin and kaempferol cause inhibition of inducible nitric oxide synthase,cyclooxygenase-2 and reactive C-protein,and down-regulation of the nuclear factor kappaB pathway in Chang Liver cells.European Journal of Phar macology,2007,557:221-229.

15 Franzotti EM,Santos CV,Rodrigues HM,et al.Anti-inflammatory,analgesic activity and acute toxicity ofSida cordifolia L.(Malva-branca).J Ethnophar m acol,2000,72:273-277.

16 Katler E,Weissmann G.Steroids,aspirin,and inflammation. Inflammation,1977,2:295-307.

17 Ueno A,Naraba H,Ikeda Y,et al.Intrinsic prostacyclin contributes to exudation induced by bradykinin or carrageenin:a study on the paw edema induced in IP-receptor-deficient mice.Life Sci,2000,66(12):PL155-160.

18 Nantel F,Denis D,Gordon R,et al.Distribution and regulation of cyclooxygenase-2 in carrageenan-induced inflammation.B r J Phar m acol,1999,128:853-859.

19 Spector WG,W illoughby DA.The inflammatory response. Bacteriol Rev,1963,27:17-154.

20 Lu TC,Ko YZ,Huang HW,et al.Analgesic and anti-inflammatory activities of aqueous extract from Glycine tomentella root in mice.J Ethnophar m acol,2007,113(1):142-148.

Analgesic and Anti-inflammatory Activities of Extracts fromLedum palustreL.in M ice

ZHANGMin,ZHAO Jing-jing,WU Wen-bin,ZHAO Yun,ZHU Xing-lei,QU Wei-jing＊
School of Life Science,East China Nor m al University,Shanghai 200062,China

In the present study,we have investigated the analgesic effect of the essential oil,methanol extract and aqueous extract ofLedum palustreby using model of acetic acid-induced writhing response and anti-inflammatory effect of these three extracts by usingmodel of lambda-carrageenan-induced paw adema in mice.In the analgesic test,methanol extract(10.0 and 1.0 mg/kg)and aqueous extract(10.0 mg/kg)decreased the acetic acid-induced writhing response.In anti-inflammatory test,methanol extract(10.0 and 1.0 mg/kg)and aqueous extract(10.0 mg/kg)decreased the paw edema at the second,third,fourth,fifth,and sixth hour after lambda-carrageenan administration.High perfor mance liquid chromatography result suggested that the analgesic and anti-inflammatory effects of methanol extract might be related to its flavonoid components.

analgesic;anti-inflammatory;aqueous and methanol extracts;flavonoid;Ledum palustreL.

1001-6880(2010)02-0326-04

2009-03-18 接受日期:2009-06-17

＊通訊作者 Tel:86-21-62232019;E-mail:wjqu@bio.ecnu.edu.cn

R285.5;Q946.91

A