劉 霞， 劉 莉， 王 鵬， 鄭曉冬

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，浙江 杭州 310023；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

羅倫隱球酵母對柑橘采后酸腐病的抑制效果*

劉 霞1， 劉 莉2， 王 鵬3， 鄭曉冬3

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，浙江 杭州 310023；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

研究了從梨果表面篩選分離到的羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)菌株對貯藏柑橘酸腐病菌(Geotrichumcitri-aurantii)的抑制作用.實驗結(jié)果表明:在25 ℃，病原菌接種量一致的條件下，羅倫隱球酵母的生物防治效果與其接種濃度和其與病原菌接種間隔時間有關(guān).當(dāng)接種病原菌的量為1×106mL-1時，1×106mL-1拮抗酵母能有效地抑制酸腐病害的發(fā)生，拮抗酵母的接種濃度越高，其抑制效果越顯著;羅倫隱球酵母同時或先于病原菌接種，可顯著抑制酸腐病害的發(fā)生.柑橘果實接種羅倫隱球酵母24 h后，多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性升高，整個實驗過程中均高于對照.采用不同的處理液處理柑橘果實，發(fā)現(xiàn)羅倫隱球酵母懸浮液和培養(yǎng)原液對酸腐病菌有較好的抑制效果，培養(yǎng)濾液和熱殺死液也有抑制效果.研究結(jié)果表明羅倫隱球酵母菌株對柑橘酸腐病害有很好的防治潛力，其抑制機理可能與營養(yǎng)和空間競爭及分泌抗菌物質(zhì)有關(guān).

羅倫隱球酵母；柑橘；酸腐??；生物防治

柑橘是世界上產(chǎn)量最多的水果，也是我國南方的主要水果之一，它的營養(yǎng)價值豐富，而且具有抗癌功效[1-3].但是,柑橘在貯藏過程中有許多毀滅性的真菌病害，除了人們熟知的青霉和綠霉病害外，近年來由Geotrichumcitri-aurantii引起的酸腐病害發(fā)展最為迅速.目前，控制柑橘侵染性病害的主要措施是使用化學(xué)殺菌劑[4-5]，但許多柑橘常用化學(xué)殺菌劑如抑霉唑、噻菌靈等對酸腐菌沒有抑制效果;另外,化學(xué)殺菌劑的長期使用易導(dǎo)致病原菌抗藥性增強，防治效果降低[4,6].近年來的研究表明果蔬采后病害的生物防治是一項很有潛力的方法，被認(rèn)為是最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一[7-8].本研究利用從梨果表面篩選到的酵母菌株，探討了其對柑橘酸腐病菌的抑制效果和拮抗機理，旨在為拮抗酵母菌的商業(yè)化應(yīng)用與開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1實驗材料

(1)拮抗酵母.按Wilson等[9]的方法從梨果表面分離篩選.獲得的羅倫隱球酵母菌株置于NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏8 g，酵母粉5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)上，4 ℃保存?zhèn)溆?

(2)病原菌.供試病原菌分離于自然發(fā)病的柑橘果實，經(jīng)鑒定為柑橘酸腐菌(Geotrichumcitri-aurantii).將酸腐菌置于PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)上，4 ℃保存?zhèn)溆?

(3)柑橘果實.供試早橘采摘自浙江省千島湖.選擇飽滿圓潤、外觀整齊、無干枯受傷和病害的果實，先用自來水清洗，然后浸入1 g/L的次氯酸鈉溶液中消毒1～2 min，取出，再用自來水沖洗掉殘余次氯酸鈉，晾干，選擇柑橘的赤道部位用滅菌的打孔器打一個直徑5 mm，深2 mm的傷口.采用各種方式處理后的果實均放在400 mm×250 mm×100 mm的塑料筐中，保鮮膜密封后保濕培養(yǎng).

1.2不同濃度酵母懸浮液對酸腐病菌抑制效果的影響

分別配制1×106,1×107,1×108,1×109mL-1拮抗酵母菌懸浮液，以無菌水作為對照.柑橘打洞后，按要求加入上述各酵母菌懸浮液30 μL，3 h后加入20 μL 1×106mL-1酸腐菌孢子懸浮液，將柑橘置于培養(yǎng)室中貯藏，貯藏溫度為25 ℃，時間為5 d.每個處理分3組，每組隨機挑選20個柑橘，貯藏結(jié)束后測定柑橘病斑直徑，記錄并計算發(fā)病率.實驗重復(fù)2次.

1.3接種時間對病原菌抑制效果的影響

取30 μL 1×108mL-1酵母菌懸浮液接入柑橘傷口處，在接種酵母菌前12和24 h,同時(0 h)及后12和24 h的不同時間內(nèi)分別接種20 μL酸腐菌孢子懸浮液，處理后風(fēng)干，放置于貯藏室，貯藏溫度為25 ℃，貯藏時間為5 d，貯藏結(jié)束后測量病斑直徑，記錄并計算腐爛率.每個處理分3組，每組隨機挑選20個柑橘.實驗重復(fù)2次.

1.4拮抗酵母對柑橘果實PPO和POD活性的誘導(dǎo)

取30 μL 1×108mL-1酵母菌懸浮液接入柑橘傷口處，于不同時間間隔(0,24,48,72,96 h)取樣測定多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性，以接種無菌水的果實作為對照，每次測定的樣品取自10個果實(傷口與完好組織的交接部位).整個實驗重復(fù)2次.

3 g果肉組織中加入1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入0.2 mol/L磷酸緩沖液10 mL(pH 7.8)，冰浴中研磨，12 000 r/min冷凍離心(4 ℃)20 min，上清液用于酶活性測定.PPO活性測定采用鄰苯二酚法[10]；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[11].

1.5拮抗酵母各種處理液對柑橘酸腐菌的抑制

分別配制1×108mL-1酵母培養(yǎng)液、1×108mL-1酵母菌懸浮液、濾液和熱殺死液，以無菌水作為對照.取上述處理液30 μL加入柑橘傷口處，3 h后再加入20 μL 1×106mL-1酸腐菌孢子懸浮液.5 d后測量病斑直徑，記錄并計算發(fā)病率，每個處理分3組，每組隨機挑選20個柑橘.實驗重復(fù)2次.

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS軟件(Version 6.08,SAS Institute Inc.,Cary,NC)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)采用ANOVA進行鄧肯式差異分析方法(Plt;0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1酵母懸浮液對柑橘采后酸腐病的防治效果

實驗結(jié)果表明:羅倫隱球酵母懸浮液的濃度越高,對Geotrichumcitri-aurantii引起的柑橘果實酸腐病發(fā)病率和病斑大小的抑制效果就越好.貯藏5 d后，1×109mL-1酵母懸浮液的抑制效果最好，果實發(fā)病率為20.8%，平均病斑直徑為7.0 mm，與其他濃度酵母懸浮液的處理效果存在顯著差異;其次是1×108mL-1酵母懸浮液，果實發(fā)病率為32.5%，病斑直徑為13.5 mm.酵母懸浮液濃度降低，其抑制效果也下降，但與對照的發(fā)病率和病斑直徑相比仍存在差異(見圖1).

圖1 不同濃度羅倫隱球酵母懸浮液對柑橘酸腐病的抑制效果

2.2接種時間間隔對病原菌抑制效果的影響

圖2 羅倫隱球酵母與酸腐菌接種時間間隔對柑橘酸腐病害抑制效果的影響

實驗結(jié)果表明:在25 ℃,羅倫隱球酵母懸浮液先于或同時于酸腐菌接種時可顯著抑制酸腐病害的發(fā)生;相反,羅倫隱球酵母后于酸腐菌接種時,酸腐病害發(fā)病率與對照相比差異不顯著(見圖2).

2.3拮抗酵母對柑橘果實PPO和POD活性的誘導(dǎo)

由圖3可知，接種羅倫隱球酵母懸浮液能夠誘導(dǎo)采后柑橘果實中PPO和POD活性的升高.接種拮抗酵母后，柑橘果實的PPO活性持續(xù)升高，48 h時達(dá)到最高峰，其值約為對照的1.4倍,隨后PPO的活性逐漸下降;而柑橘果實的POD活性在24 h以前一直處于下降的趨勢，24 h時達(dá)到最低點，隨后活性逐漸升高，48 h時達(dá)到最高峰，其值約為對照的1.5倍.但是,在整個實驗過程中，接種拮抗酵母果實的PPO和POD活性明顯高于對照.

2.4拮抗酵母各種處理液對柑橘病害的抑制效果

實驗結(jié)果表明:1×108mL-1羅倫隱球酵母懸浮液與培養(yǎng)原液處理的柑橘果實在25 ℃貯藏5 d，酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑都顯著低于濾液、熱殺死液處理的柑橘和對照(見圖4).羅倫隱球酵母懸浮液處理的果實酸腐病發(fā)病率和病斑直徑為32.5%和7.0 mm，明顯低于對照的發(fā)病率(88.5%)和病斑直徑(23.5 mm).但是，實驗結(jié)果還表明:濾液和熱殺死液對酸腐病菌也有抑制效果，而且濾液的抑制效果顯著好于熱殺死液，其發(fā)病率和病斑直徑分別為60.5%和13.5 mm,79.5%和20.0 mm.

圖3 羅倫隱球酵母對柑橘果實PPO和POD活性的影響

A：熱殺死液；B：濾液；C：培養(yǎng)原液(1×108 mL-1)；D：酵母懸浮液(1×108 mL-1)圖4 羅倫隱球酵母不同處理液對柑橘酸腐病害的抑制效果

3 討 論

生物防治是采用微生物菌株或抗菌素類物質(zhì)，通過噴灑或浸漬果實，以降低或防治果實采后病害的保鮮方法[12].文獻[13]曾報道Debaryomyceshansenii對柑橘采后綠霉、青霉和酸腐病害有很好的抑制效果.柑橘采后青霉和綠霉病害也能夠分別被粘紅酵母和枯草芽孢桿菌PY-1所抑制[14-15].文獻[16]報道了Cryptococcuslaurentii(Kufferath) Skinner對柑橘采后青霉病害有很好的抑制效果.本實驗結(jié)果表明:從梨果表面分離得到的羅倫隱球酵母菌株對貯藏柑橘酸腐病有抑制作用;在25 ℃,當(dāng)接種酸腐菌1×106mL-1時，拮抗酵母的接種濃度越高，抑制效果越好;羅倫隱球酵母先于或同時與病原菌接種，5 d后能夠較好地抑制酸腐病的發(fā)生，而后于病原菌接種則無防治效果.

長期以來，PPO一直被認(rèn)為是引起果實褐變的主要因素[17]，而它在植物抗病反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用[18].PPO可催化木質(zhì)素及其他酚類氧化產(chǎn)物的形成，構(gòu)成保護性屏蔽而抵抗病菌的入侵，也可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用[18].而POD在木質(zhì)素生物合成的最后一步中催化H2O2分解而發(fā)揮作用.本實驗發(fā)現(xiàn)，接種拮抗酵母24 h后能誘導(dǎo)柑橘果實PPO和POD活性升高，而且一直處在高于對照的水平,與此相伴隨的是:果實的發(fā)病率低，病斑直徑也較小.說明拮抗酵母對酸腐病菌的拮抗作用與誘導(dǎo)果實PPO和POD活性的提高存在著顯著關(guān)系.

本研究中拮抗酵母的培養(yǎng)原液和懸浮液對柑橘酸腐菌都有顯著的抑制作用，而濾液與熱殺死液對柑橘果實酸腐病害的發(fā)生也有抑制作用，只是與前兩者相比效果稍差.但這也說明，羅倫隱球酵母在培養(yǎng)過程中可能會分泌一些對酸腐菌有抑制作用的物質(zhì)，該物質(zhì)的成分還需要進一步分析研究.

總之，羅倫隱球酵母的拮抗機理被認(rèn)為主要是營養(yǎng)與空間競爭[19].另外，與病原菌粘合[20]、誘導(dǎo)果實抗性或抗性相關(guān)反應(yīng)[21]、降解病原菌分泌的真菌毒素[22]等也有報道.而在抵御由Geotrichumcitri-aurantii引起的柑橘果實酸腐病的過程中，除了營養(yǎng)與空間競爭和誘導(dǎo)抗性反應(yīng)外，拮抗酵母所分泌的物質(zhì)也發(fā)揮了重要作用.但是,拮抗酵母拮抗效果的產(chǎn)生往往是多種機制共同作用的結(jié)果.因此,該酵母是否存在著其他的拮抗機制還有待于進一步探討.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

EfficacyofbiologicalcontrolsourrotofcitrusfruitbyCryptococcuslaurentii

LIU Xia1, LIU Li2, WANG Peng3, ZHENG Xiaodong3

(1.CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China; 2.DepartmentofBiotechnology,HangzhouWanxiangPolytechnic,HangzhouZhejiang310023,China; 3.DepartmentofFoodScienceandNutrition,ZhejiangUniversity,HangzhouZhejiang310029,China)

Sour rot of citrus fruit could be significantly suppressed byCryptococcuslaurentii. The biocontrol efficacy ofC.laurentiiwas related to the concentrations of the yeast cells and application time. Higher efficacy was achieved when fruits were treated with high concentration ofC.laurentii(gt;1×106mL-1) and with low concentration ofGeotrichumcitri-aurantii(1×106mL-1) at 25 ℃. The efficacy ofC.laurentiiwas consistent when applied at the same time or before the pathogen. The activities of PPO and POD in citrus increased significantly after 24 h of inoculation withC.laurentii. The biocontrol mechanism ofC.laurentiiwas detected by comparing the efficacy of different treatments. The results demonstrated that the disease incidence for the treatments of living cell suspension and washed cell suspension ofC.laurentiiwas significantly lower than that for the culture filtrate and autoclaved cell suspensions. It was suggested thatC.laurentiihad a great potential to control sour rot of citrus fruit. The biocontrol mechanism might be the competition of nutrition and space, and secretion of antagonistic substances.

Cryptococcuslaurentii; citrus; sour rot; biological control

1001-5051(2010)01-0013-05

2009-12-29

“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2006BAD22B02)；浙江師范大學(xué)博士科研啟動資金資助項目

劉 霞(1977-)，女，山東濟寧人，講師，博士.研究方向：果蔬病害生物防治.

S432.4+4

A