許娟娟 彭晶晶 胡耿誠 錢偉 丁震 劉俊 侯曉華

·論著·

八面蒙脫石聯(lián)合莫沙必利灌胃對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠回腸NF-κB活化的影響

許娟娟 彭晶晶 胡耿誠 錢偉 丁震 劉俊 侯曉華

目的探討八面蒙脫石對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠回腸黏膜NF-κB活化的影響。方法120只雄性SD大鼠按完全隨機(jī)法分為假手術(shù)組、ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組和莫沙比利+八面蒙脫石(聯(lián)合)組，每組24只大鼠。采用胰膽管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠ANP模型；假手術(shù)組開腹注射生理鹽水后關(guān)腹。各治療組于造模前30 min分別給予相應(yīng)藥物灌胃1次。術(shù)后3、6、12 h分批處死動(dòng)物。取胰腺組織行病理檢查；取血測(cè)定TNF-α、IL-1水平；取回腸觀察超微結(jié)構(gòu)的改變；免疫組化法檢測(cè)回腸黏膜NF-κB的表達(dá)；Western blotting法檢測(cè)回腸組織IκBα水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，ANP組胰腺損傷明顯，血TNF-α、IL-1水平明顯升高[(36.79±1.14)pg/ml對(duì)(9.00±0.01)pg/ml，(25.17±1.93)ng/ml對(duì)(3.45±0.11)ng/ml,P值均<0.05]，回腸絨毛高度顯著下降[(0.25±0.22)×10-6m對(duì)(1.50±0.33)×10-6m，P<0.05]，柱狀細(xì)胞指數(shù)顯著降低[(2.40±1.65)×106個(gè)/m對(duì)(13.5±4.28)×106個(gè)/m，P<0.05]，NF-kB表達(dá)增加(6.92±1.54對(duì)1.28±0.29，P<0.05)，IκBα蛋白水平下降(3.30±1.99對(duì)24.32±1.93 )。莫沙必利組和八面蒙脫石組的各項(xiàng)指標(biāo)與ANP組均無顯著差異。聯(lián)合組的血TNF-α、IL-1水平[(30.57±0.39)pg/ml和(13.45±1.26)ng/ml]、回腸絨毛高度和柱狀細(xì)胞指數(shù)[(1.05±0.28)×10-6m和(10.10±2.50)×106個(gè)/m]、NF-kB活化(4.32±1.57)和IκBα蛋白水平(15.99±1.26)均與ANP組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均<0.05)。結(jié)論八面蒙脫石聯(lián)合莫沙必利灌胃能減少ANP大鼠回腸黏膜NF-κB的大量激活，減輕胰腺和回腸黏膜的損傷程度。

胰腺炎，急性壞死性； NF-κB； IκBα； 回腸； 八面蒙脫石； 莫沙必利

重癥急性胰腺炎(SAP)是常見的急腹癥之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有多種因子參與并起著非常重要的作用[1]。NF-κB作為重要的基因轉(zhuǎn)錄因子，在SAP中高表達(dá)并對(duì)SAP的發(fā)生發(fā)展起重要作用[2]。八面蒙脫石可吸附多種病原體，保護(hù)腸黏膜屏障，減少因細(xì)菌內(nèi)毒素易位而引起的炎癥介質(zhì)過度釋放[3]。因此，本研究應(yīng)用八面蒙脫石治療急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察其對(duì)腸道損傷的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。由于ANP時(shí)常并發(fā)腸蠕動(dòng)減緩，為確保八面蒙脫石到達(dá)腸道，本實(shí)驗(yàn)加用促胃腸動(dòng)力藥莫沙必利。

材料和方法

一、動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

120只雄性SD大鼠，體重200～250 g，清潔級(jí)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。大鼠按完全隨機(jī)法分為假手術(shù)組、ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組和八面蒙脫石+莫沙必利(聯(lián)合)組，每組24只。采用逆行胰膽管注射?；悄懰徕c制備ANP模型[4]。假手術(shù)組開腹注射生理鹽水后關(guān)腹，其他各組于造模前30 min分別應(yīng)用生理鹽水、0.03%莫沙必利、6%八面蒙脫石、莫沙必利+八面蒙脫石灌胃1次，灌胃劑量為0.1 ml/100 g體重。術(shù)后3、6、12 h分批處死大鼠。

二、血TNF-α、IL-1檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說明書操作。

三、胰腺及回腸組織病理檢查

胰腺組織常規(guī)行病理學(xué)檢查，按照許永春等[4]的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分?；啬c組織送華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院電鏡中心行超微結(jié)構(gòu)檢查。

四、回腸組織NF-κB表達(dá)的檢測(cè)

采用S-P免疫組化法。一抗工作濃度為1∶100。每張切片取5個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus分析軟件測(cè)定NF-κB蛋白陽性產(chǎn)物的積分光密度值，取均值。

五、回腸組織IκBα表達(dá)的檢測(cè)

取50 mg回腸組織，用PIRA裂解液制備勻漿，蛋白定量后行Western blotting。用惠普掃描儀掃描，quantity one軟件計(jì)算各條帶灰度值，以IκBα/β-actin的灰度值比作為IκBα相對(duì)表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、胰腺組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組胰腺正常。ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組大鼠初期胰腺水腫，以后出現(xiàn)皂化斑及出血壞死灶，有血性腹水；鏡下胰腺間質(zhì)水腫，隨時(shí)間延長(zhǎng)，腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞，出血，凝固性或脂肪壞死，大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。聯(lián)合組胰腺損傷明顯減輕，胰腺病理評(píng)分較ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組顯著降低(P<0.05，圖1、圖2)。

圖1 假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、莫沙必利組(c)、八面蒙脫石組(d)和聯(lián)合組 (e) 6 h點(diǎn)的胰腺病理改變(HE ×20)

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與ANP組比較,bP<0.05

二、回腸組織超微結(jié)構(gòu)改變

假手術(shù)組回腸絨毛高度為(1.50±0.33)×10-6m；柱狀細(xì)胞指數(shù)(柱狀細(xì)胞數(shù)/肌層黏膜長(zhǎng)度)為(13.5±4.28)×106個(gè)/m。ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組回腸組織緊密連接條索縮短、數(shù)量減少甚至結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞凋亡明顯增加(圖3)，回腸絨毛高度分別為(0.25±0.22)×10-6m、(0.38±0.27)×10-6m、(0.33±0.26)×10-6m；柱狀細(xì)胞指數(shù)分別為(2.40±1.65)×106個(gè)/m、(3.00±1.43)×106個(gè)/m、(2.60±2.52)×106個(gè)/m。均顯著低于假手術(shù)組(P值均<0.05)。聯(lián)合組為(1.05±0.28)×106m和(10.10±2.50)×106個(gè)/m，均顯著高于上述3組(P<0.05)，而與假手術(shù)組無顯著差異。

三、各組血TNF-α、IL-1水平的變化

ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組血清TNF-α、IL-1水平較假手術(shù)組明顯升高(P值均<0.05)，而聯(lián)合組較上述3組顯著降低(P值均<0.05)，但仍顯著高于假手術(shù)組(表1，P<0.05)。

四、回腸黏膜組織NF-κB表達(dá)

假手術(shù)組少見NF-κB的陽性表達(dá)；ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組見大量NF-κB陽性細(xì)胞,主要位于腸絨毛頂端的腸上皮細(xì)胞和靠近腸絨毛頂端的單核細(xì)胞；聯(lián)合組活化細(xì)胞數(shù)減少(圖4)。5組NF-κB 活化量分別為1.28±0.29、6.92±1.54、6.28±1.59、6.34±1.43和4.32±1.57。聯(lián)合組較ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組顯著減少(P值均<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。

表1 各組大鼠血TNF-α和IL-1水平的變化

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與ANP組比較,bP<0.05

五、回腸組織IκBα蛋白水平的變化

假手術(shù)組3、6、12 h的 IκBα蛋白表達(dá)量分別為25.17±0.56、24.32±1.93、24.01±1.12；ANP組為4.46±1.45、3.30±1.99、3.36±1.23；莫沙比利組為7.46±3.57、4.54±1.67、5.43±4.09；八面蒙脫石組為6.23±3.12、4.11±1.47、3.13±2.96；聯(lián)合組為17.35±0.95、15.99±1.26、18.23±1.94。ANP組與莫沙比利組及八面蒙脫石組無明顯差異；聯(lián)合組較上述3組均明顯增加(P值均<0.05，圖5)。

圖3假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、莫沙比利組(c)、八面蒙脫石組(d)和聯(lián)合組 (e) 6 h點(diǎn)的回腸組織超微結(jié)構(gòu)變化( ×4000)

圖4假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、莫沙比利組(c)、八面蒙脫石組(d)和聯(lián)合組 (e) 6 h點(diǎn)的回腸黏膜組織NF-κB 的活化狀況( ×20)

圖5 各組回腸組織IκBα蛋白表達(dá)

討 論

文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，八面蒙脫石可通過自身與腸黏液分子間的相互作用，增加黏液的內(nèi)聚力、粘彈性和存在時(shí)間，從而保護(hù)腸細(xì)胞頂端和細(xì)胞間橋免受損壞，促進(jìn)上皮細(xì)胞再生和修復(fù)，同時(shí)可以覆蓋在消化道黏膜表面，加強(qiáng)由黏液免疫球蛋白A和正常菌群組成的黏膜防御屏障，恢復(fù)腸上皮細(xì)胞的正常吸收分泌功能。但其在SAP時(shí)的應(yīng)用尚未見報(bào)道。因急性胰腺炎時(shí)小腸動(dòng)力功能減退[8]，導(dǎo)致藥物無法順利到達(dá)腸道發(fā)揮作用，為此，本文聯(lián)合應(yīng)用促胃腸蠕動(dòng)劑莫沙必利，以保證八面蒙脫石到達(dá)腸道充分發(fā)揮藥物作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合組大鼠回腸絨毛高度和柱狀細(xì)胞指數(shù)均顯著高于ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組，而與假手術(shù)組無顯著差異，提示聯(lián)合應(yīng)用莫沙必利和八面蒙脫石能減輕腸黏膜的損傷。

NF-κB在全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)生過程中起著核心作用，調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合組NF-κB活化較ANP組、莫沙必利組和八面蒙脫石組顯著減少，而IκBα蛋白顯著增加，表明聯(lián)合應(yīng)用莫沙必利和八面蒙脫石才能保證八面蒙脫石抑制NF-κB活化的作用。

研究證實(shí)，NF-κB對(duì)TNF-α的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[10]。而TNF-α又可激活I(lǐng)L-1、IL-6、IL-8、白細(xì)胞趨化因子、黏附分子等細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合組大鼠血TNF-α和IL-1的水平均明顯較ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組下降，可能與八面蒙脫石減少了NF-κB的大量活化有關(guān)。

此外，當(dāng)聯(lián)合給予八面蒙脫石和莫沙必利灌胃后，除了回腸組織損傷好轉(zhuǎn)外，胰腺的病理損傷也減輕，表明八面蒙脫石同樣能減輕胰腺的損傷。

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2009-03-31)

(本文編輯：屠振興)

RoleofoctahedralmontoneandmosaprideonileumNF-κBactivationinratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUJuan-juan,PENGJing-jing,HUGeng-cheng,QIANWei,DINGZheng,LIUJun,HOUXiao-hua.

DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

LIUJun,Email:liujun-99@126.com

ObjectiveTo investigate the role of octahedral montone on ileum NF-κB activation in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods120 SD rats were randomly divided into sham-operation group (A), ANP group (B), mosapride treatment group (C), montone treatment group (D), montone and mosapride treatment group (E). Retrograde pancreatic duct injection of sodium taurocholate was used to establish ANP models, octahedral montone and mosapride were given by intragastric feeding 30 min before ANP model induction. group A was injected NS after opening the abdomen. Pancreatic tissue injury was evaluated; the serum level of TNF-α and IL-1 was determined; the ultrastructural changes of the ileum was observed.The expression of NF-κB in the ileum mucosa was detemined by immunohistochemistry. The expression of IκBα protein in the ileum tissue was determined by Western blotting.ResultsCompared with group A, pancreatic tissue injury was more severe in group B, and serum level of TNF-α and IL-1 was much higher in group B[(36.79±1.14)vs(9.00±0.01)pg/ml, (25.17±1.93)vs(3.45±0.11)ng/ml,P<0.05]; the height of the villi was significantly lower [(0.25±0.22)×10-6mvs(1.50±0.33)×10-6m,P<0.05)], the index of columnar cell was significantly lower [(2.40±1.65)×10-6mvs(13.5±4.28)×106/m,P<0.05)]; the expressions of NF-κB was significantly eleveted (6.92±1.54vs1.28±0.29,P<0.05), the expressions of IκBα protein was significantly decreased (3.30±1.99vs24.32±1.93). There was no significant difference between group D and C. The serum level of TNF-α and IL-1 [(30.57±0.39)pg/ml and (13.45±1.26)ng/ml], the height of the villi and the index of columnar cell [(1.05±0.28)×10-6m and (10.10±2.50)×106/m] and the expressions of NF-kB (4.3240±1.5657) and IκBα (15.987±1.262) was statistically significantly different compared with those of the ANP group (P<0.05).ConclusionsOctahedral montone and mosapride could decrease the NF-κB activation and ameliorate the inflammation of ileum and pancreas during the course of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; NF-κB; IκBα; Ileum; Octahedral montone; Mosapride

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.015

430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

劉俊，Email: liujun-99@126.com