王曉亮 湯志剛 翁海燕 黃強 陳炯 胡曄

·論著·

益生菌型腸內營養(yǎng)對急性壞死性胰腺炎大鼠炎癥反應和免疫功能的影響

王曉亮 湯志剛 翁海燕 黃強 陳炯 胡曄

目的評價早期應用益生菌型腸內營養(yǎng)對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠炎癥反應和免疫功能的影響。方法100只SD大鼠按數(shù)字表法隨機分為對照組、ANP組、傳統(tǒng)腸內營養(yǎng)(瑞素)組、益生菌組和瑞素+益生菌(聯(lián)合)組，每組20只。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1.5 ml/kg體重方法制備ANP模型。另經胃留置空腸營養(yǎng)管。各組于術后12、24、48、72 h分批處死大鼠，取血檢測血清巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、淀粉酶水平及T細胞亞群，取胰腺組織常規(guī)病理檢查，并采用免疫組化法檢測胰腺組織MIF的表達。結果制模后各組MIF、淀粉酶水平較對照組明顯升高。制模后72 h，瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組血MIF水平分別為(117.59±1.86)μg/L、(108.39±1.99) μg/L和(95.33±1.96) μg/L，血淀粉酶水平分別為(2799±161)U/L、(2482±140)U/L和(2146±572)U/L，益生菌組和聯(lián)合組均較瑞素組顯著下降(P<0.05)，聯(lián)合組又較益生菌組顯著下降(P<0.05)。制模后各組CD3+、CD4+細胞和CD4+/CD8+值較對照組下降。制模后72 h，瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組的CD4+/CD8+值分別為0.93±0.12、1.31±0.13、1.51±0.10，益生菌組和聯(lián)合組均較瑞素組顯著回升(P<0.05)，聯(lián)合組又較益生菌組顯著回升(P<0.05)。對照組、ANP組、瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組MIF陽性表達率分別為45%、96%、95%、65%和60%，益生菌組和聯(lián)合組較ANP組和瑞素組顯著降低(P<0.05)。制模后72 h聯(lián)合組大鼠胰腺病理損傷較瑞素組和益生菌組輕。結論益生菌型腸內營養(yǎng)能有效調節(jié)ANP大鼠炎癥介質和細胞因子水平，增強機體免疫功能。

胰腺炎，急性壞死性； 腸道營養(yǎng)； 益生菌

腸內營養(yǎng)在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)中的治療作用已得到多數(shù)動物實驗和臨床試驗的證實[1-2]，但關于益生菌型腸內營養(yǎng)對機體炎癥反應和免疫應答功能影響的研究報道較少[3-4]。本實驗旨在探討益生菌型腸內營養(yǎng)對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠炎癥反應、免疫功能的影響，以指導臨床應用。

材料與方法

一、模型制備及實驗分組

雄性SD大鼠100只，體重260～300 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。采用數(shù)字表法隨機分為對照組、ANP組、瑞素組、益生菌組(雙岐桿菌、嗜酸乳桿菌、腸球菌三聯(lián)活菌制劑)和瑞素+益生菌(聯(lián)合)組，每組20只大鼠。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1.5 ml/kg體重方法制備ANP模型。另經胃造口置內徑1 mm硅膠管于空腸上段2 cm處。對照組輕翻胰腺后縫合切口。術后6 h用2 ml生理鹽水沖洗腸管，8 h后瑞素組腸內灌注25%瑞素液(華瑞制藥有限公司)5 ml，益生菌組灌注益生菌制劑(上海信誼制藥總廠產品)5 ml，聯(lián)合組將益生菌置于5 ml 25%瑞素液中灌注。灌注前測定含菌活量達109CFU/ml。每隔2 h灌注1次，共8次。術后12、24、48、72 h分批處死大鼠，取血及胰腺組織。

二、淀粉酶、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)檢測

經Beckman全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶水平，采用ELISA法(試劑盒購自R&D公司)檢測MIF水平。

三、T細胞亞群檢測

取外周抗凝血2 ml加淋巴細胞分離液密度梯度離心收集淋巴細胞。取1×105個細胞，加入抗CD3+、CD4+、CD8+抗體，4℃避光孵育30 min，立即上流式細胞儀(Beckman-Coulter公司，型號EPICS-XLII)進行檢測。

四、胰腺病理檢查及MIF表達檢測

胰腺標本常規(guī)病理檢查。采用免疫組化染色檢測胰腺組織MIF表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。以胞質出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，以陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比評判染色強度：﹤5%為-，5%～25%為+，﹥25%為++。

五、統(tǒng)計學方法

結 果

一、一般情況

各組大鼠均無腸內營養(yǎng)所致并發(fā)癥發(fā)生。建模后72 h，各組死亡率分別為0(0/20)、55.0%(11/20)、40.0%(8/20)、25.0%(5/20)、25.0%(5/20)。

二、血淀粉酶和MIF水平變化

制模后12 h，ANP組、瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組血清淀粉酶、MIF水平均較對照組明顯升高(P<0.05)。制模后72 h，ANP組維持高水平，益生菌組和聯(lián)合組下降且均較瑞素組顯著(P<0.05)，聯(lián)合組的MIF水平又較益生菌組下降顯著(P<0.05，表1)。

三、T細胞亞群變化

制模后12 h，ANP組、瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組CD3+、CD4+細胞和CD4+/CD8+值均較對照組顯著下降(P<0.05)。制模后72 h，ANP組維持低值，益生菌組和聯(lián)合組CD3+、CD4+細胞和CD4+/CD8+值回升，且明顯高于瑞素組(P<0.05)，聯(lián)合組又較益生菌組回升明顯(P<0．05，表1)。

四、胰腺病理學改變及MIF的表達

對照組胰腺組織輕度水腫及少量炎癥細胞浸潤；ANP組胰腺明顯出血、壞死，腺泡結構破壞；瑞素組胰腺組織部分出現(xiàn)壞死及出血，腺小葉結構消失；益生菌組和聯(lián)合組胰腺病變程度相似，均較瑞素組輕(圖1)。

對照組胰腺組織MIF弱表達，ANP組和瑞素組陽性細胞數(shù)增加、染色增強，而益生菌和聯(lián)合組胰腺組織MIF表達較瑞素組減弱(圖2)。5組MIF陽性表達率分別為45%、96%、95%、65%和60%，益生菌組和聯(lián)合組較ANP組和瑞素組顯著降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠T細胞亞群、血清淀粉酶水平、MIF濃度的比較

注：與同時點對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05；與瑞素組比較，cP<0.05；與益生菌組比較，dP<0.05

a.對照組；b.ANP組；c.瑞素組；d.益生菌組；e.聯(lián)合組(HE ×200)

a.對照組；b.ANP組；c.瑞蘇組；d.益生菌組；e.聯(lián)合組(免疫組化 ×400)

SAP時，由于腸道動力紊亂、腸道菌群失調、腸黏膜上皮細胞過度凋亡，導致腸黏膜屏障損傷，腸道菌群易位，易并發(fā)感染和多器官功能不全綜合征(MODS)，成為SAP患者后期高病死率的重要原因。目前，免疫功能在急性胰腺炎病理生理過程中的重要性日益受到關注，如何增強腸道局部和系統(tǒng)免疫功能成為SAP臨床和實驗研究的熱點。

T細胞亞群的變化反映了細胞免疫功能的改變，CD3+、CD4+T細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值降低表明機體處于免疫抑制狀態(tài)[5]。MIF是先天性免疫和獲得性免疫的重要調節(jié)因子，在機體炎癥和免疫反應中起重要作用，可能會加重SAP及相關肺損傷[6]。益生菌型腸內營養(yǎng)是指增加益生菌的營養(yǎng)制劑，它可建立宿主和微生物之間的共生關系，促進腸上皮細胞更新，增加腸黏膜血流量和調節(jié)腸蠕動，加強腸黏膜免疫系統(tǒng)的功能[7-8]。

本實驗對照組大鼠無死亡，ANP組死亡率較高，但各組之間死亡率無統(tǒng)計學差異。制模后各組血清淀粉酶、MIF水平升高。制模后72 h，給予營養(yǎng)支持的3組血淀粉酶及MIF水平均下降，其中聯(lián)合組下降較益生菌組顯著，益生菌組又較瑞素組下降顯著，表明聯(lián)合益生菌行腸內營養(yǎng)在減輕炎癥反應方面效果更好。制模后各組CD3+、CD4+T細胞和CD4+/CD8+比值均降低，提示ANP早期已有不同程度的免疫功能抑制。制模后72 h，營養(yǎng)支持各組各指標回升，其中聯(lián)合組回升最高，提示聯(lián)合組的營養(yǎng)支持對ANP大鼠免疫抑制狀態(tài)的改善，抑制炎癥介質和細胞因子的釋放效果最明顯。胰腺組織病理的改變及MIF表達的變化也證實了這一點。因此，臨床上應推薦使用益生菌型腸內營養(yǎng)。

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2009-05-06)

(本文編輯：屠振興)

Effectofprobioticsenteralnutritionontheinflammatoryresponseandimmunefunctioninratswithacutenecrotizingpancreatitis

WANGXiao-liang,TANGZhi-gang,WENGHai-yan,HUANGQiang,CHENJiong,HUYe.

DepartmentofGeneralSurgery,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China

TANGZhi-gang,Email:tougao_100@163.com

ObjectivesTo evaluate the effect of probiotics enteral nutrition therapy on the inflammatory reaction and immune function in acute necrotizing pancreatitis (ANP) in rats.Methods100 SD rats were divided randomly into control group (C group,n=20), ANP group, enteral nutrition group (EN group,n=20), probiotics group (P group,n=20) and enteral nutrition plus probiotics group (PEN group,n=20). ANP were induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (1.5 ml/kg) into the biliary and pancreatic duct. The nasojejunal tube was placed via gastric route. The rats were sacrificed at 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after ANP modeling. Serum MIF and amylase levels, as well as CD3+, CD4+, CD8+were measured and MIF was determined by immunohistochemistry and the histopathological changes in pancreatic tissue were observed.ResultsSerum MIF and amylase levels were all increased when compared with that in C group. 72 h after ANP modeling, serum MIF levels in EN, P, PEN groups were (117.59±1.86)μg/L,(108.39±1.99)μg/L and (95.33±1.96)μg/L, respectively; serum amylase levels were (2799±161)U/L, (2482±140)U/L and (2146±572)U/L, respectively; the values in P and PEN groups were significantly lower than that of EN group (P<0.05), the values in PEN groups were significantly lower than that of P group (P<0.05). After ANP induction, CD4+/CD8+values in EN, P and PEN groups were 0.93±0.12, 1.31±0.13, 1.51±0.10, respectively; the values in P and PEN groups were significantly higher than that of EN group (P<0.05), the values in PEN groups were significantly higher than that of P group (P<0.05). MIF positive rates in C, ANP, EN, P and PEN group were 45%, 96%, 95%, 65% and 60%,respectively; the values in P and PEN groups were significantly lower than those of ANP and EN group (P<0.05). At 72 h, the damage of pancreatic tissue was more severe in EN and P groups than that in PEN group.ConclusionsProbiotics enteral nutrition could effectively regulate inflammation mediator and cytokines in rats with ANP, and enhance immune function.

Pancreatitis, acute necrotizing； Enteral nutrition； Probiotics

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.013

2008年安徽省臨床醫(yī)學重點學科新技術引進項目(2008N017)

230001 合肥，安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院保健中心11樓普外科

湯志剛，Email:tougao_100@163.com