張玲 高軍 龔燕芳 李兆申 吳洪玉 金晶 滿曉華

·論著·

人NPTX2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

張玲 高軍 龔燕芳 李兆申 吳洪玉 金晶 滿曉華

目的構(gòu)建人神經(jīng)元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞PANC1，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。方法通過雙酶切的方法獲得人NPTX2全長(zhǎng)cDNA，利用NotⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)將其插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC1細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量PCR方法篩選NPTX2 mRNA高表達(dá)克隆。結(jié)果成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC1細(xì)胞，成功表達(dá)了目的基因。結(jié)論真核表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步研究NPTX2基因在胰腺癌細(xì)胞的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

胰腺腫瘤； NPTX2； 轉(zhuǎn)染； 細(xì)胞系

材料與方法

一、主要試劑

含人NPTX2全長(zhǎng)cDNA的pReceiver-M15-NPTX2質(zhì)粒購自廣州復(fù)能基因公司。質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和人胰腺癌細(xì)胞系PANC1為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；SYBR Green Master Mix購自TOYOBO公司；凝膠回收試劑盒購自維特潔公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京博大泰克公司；LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；G418購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；SuperECL購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗人NPTX2多克隆抗體購自Protein Tech Group公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司；羊抗小鼠IgG購自GenScript公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自上海普飛生物技術(shù)有限公司。

二、人NPTX2真核表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)pReceiver-M15-NPTX2和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒分別行EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切。酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、切割，回收獲取NPTX2片段(1326 bp)和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒大片段。經(jīng)T4連接酶16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)胞，氨芐青霉素(60 μg/ml)篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

三、人NPTX2轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞

PANC1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至90%～95%時(shí)，應(yīng)用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-NPTX2轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞。48 h后在含G418(1000 μg/ml)的培養(yǎng)基中加壓篩選2周，獲得具有抗性的陽性細(xì)胞克隆，繼續(xù)在含G418(500 μg/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)人NPTX2的PANC1細(xì)胞(PANC1-NPTX2)。

四、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NPTX2 mRNA的表達(dá)

收集pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及PANC1-NPTX2。應(yīng)用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，取2 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR Green摻入法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。NPTX2上游引物5′-CCTCCCACTCCGCAC-AAAC-3′，下游引物5′-CACCGCATAGGAGAAGGGG-3′，擴(kuò)增片段133 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，擴(kuò)增片段145 bp。以去核酸無菌水作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用ABI 7500 system soft進(jìn)行分析，標(biāo)本中NPTX2基因的CT值通過下列公式進(jìn)行計(jì)算：△CT =NPTX2的CT值-GAPDH的CT值，△△CT =樣本△CT -對(duì)照△CT，NPTX2基因相對(duì)表達(dá)量為2-△△CT。

五、蛋白印跡法檢測(cè)NPTX2蛋白的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解制備蛋白樣品，常規(guī)行Western blotting。兔抗人NPTX2一抗1∶800稀釋，小鼠抗人β-actin抗體1∶10 000稀釋，羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗1∶2000稀釋，羊抗鼠HRP標(biāo)記的二抗1∶5000稀釋。最后ECL發(fā)光，暗室中顯影、定影。應(yīng)用ImageJ軟件掃描條帶光密度，以NPTX2/β-actin的光密度比值表示NPTX2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，兩組NPTX2 mRNA表達(dá)量采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-NPTX2的酶切鑒定

NPTX2全長(zhǎng)cDNA為1326 bp。pcDNA3.1(+)-NPTX2經(jīng)雙酶切后電泳可見略小于1500 bp的片段(圖1)，對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1(+)無此片段。

圖1pcDNA3.1(+)-NPTX2質(zhì)粒(1～4)和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(5)酶切鑒定電泳圖

二、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-NPTX2的測(cè)序鑒定

將含pcDNA3.1(+)-NPTX2重組質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆菌液送至上海英俊公司測(cè)序。應(yīng)用Chromas和DNAman 軟件分析測(cè)序結(jié)果，證實(shí)了所提供的重組質(zhì)粒均包含1326 bp插入片段，與GenBank中公布的NPTX2 mRNA序列匹配，同源性均為100%，且含有pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的序列。

三、轉(zhuǎn)染的PANC1細(xì)胞NPTX2 mRNA的表達(dá)

GAPDH mRNA與NPTX2 mRNA均有較好的擴(kuò)增曲線與溶解曲線(圖2)。設(shè)對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PANC1細(xì)胞NPTX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(relative quantity, RQ)為1，則PANC1-NPTX2的NPTX2 mRNA的RQ值為30.089，兩組差異顯著(P<0.05)。

圖2GAPDH(A、B)和NPTX2(C、D)的融解曲線和擴(kuò)增曲線

四、轉(zhuǎn)染細(xì)胞NPTX2蛋白的表達(dá)

空白對(duì)照PANC1細(xì)胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均未檢測(cè)到NPTX2蛋白的表達(dá)，pcDNA3.1-NPTX2轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)到NPTX2蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的NPTX2蛋白表達(dá)

NPTX2基因又稱為神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)正五聚體蛋白(neuronal activity-regulated pentraxin, Narp)。目前針對(duì)該蛋白研究較多地集中在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如癲癇發(fā)作和帕金森病[6-9]，在胰腺疾病的研究尚少。為此，本文將NPTX2基因轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

利用表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)[10]。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，且所需成本相對(duì)低廉。但該系統(tǒng)存在許多難以克服的缺點(diǎn)，如原核表達(dá)缺乏轉(zhuǎn)錄后修飾。為此，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[11]。

本研究采用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)pcDNA3.1(+)。

它不僅含有氨芐青霉素抗性可用于原核擴(kuò)增，還含有新霉素抗性可用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)株。我們將人NPTX2全長(zhǎng)cDNA成功地插入pcDNA3.1(+)載體的CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建NPTX2真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定正確無誤后，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將pcDNA3.1(+)-NPTX2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，通過G418篩選建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)到NPTX2基因的表達(dá)，表明重組的人NPTX2基因在PANC1細(xì)胞中能有效地被轉(zhuǎn)錄和翻譯，成功地建立了一個(gè)在基因組DNA中穩(wěn)定整合有pcDNA3.1(+)-NPTX2載體的PANC1細(xì)胞系。

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2008-12-05)

(本文編輯：屠振興)

Constructionofeukaryoticvectorofhumanneuronalpentraxin2andestablishmentofstabletransfectedPANC1cellline

ZHANGLing,GAOJun,GONGYan-fang,LIZhao-shen,WUHong-yu,JINJing,MANXiao-hua.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo construct eukaryotic vector of human neuronal pentraxin 2 (NPTX2), and obtain the stable transfected PANC1 cell lines.MethodsThe full-length cDNA of NPTX2 was digested by EcoR1 and Not1, and was cloned into plasmid pcDNA3.1, which were confirmed by sequencing, then the pcDNA3.1 (+) and pcDNA3.1 (+)-NPTX2 vectors were transfected into PANC1 cells by LipofectamineTM2000. The stable transfected PANC1 cell lines were selected by the ability of resistance to G418. The NPTX2 mRNA expression of PANC1 in the selected clones was detected by real-time quantitative PCR.ResultsThe eukaryotic vector pcDNA3.1 (+)-NPTX2 was constructed successfully, stable transfected PANC1 cell line was established and confirmed by real-time quantitative PCR.ConclusionsThe construction of eukaryotic vector targeting NPTX2 and the established stable transfected PANC1 cell line provided a solid experimental foundation for further studies on the function of NPTX2 in pancreatic cancer cells.

Pancreatic neoplasms; NPTX2; Transfection; Cell line

研究表明，胰腺癌存在遺傳學(xué)改變及表觀遺傳學(xué)變化[1-3]，但是，迄今為止胰腺癌的確切分子發(fā)病機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)元正五聚蛋白2(neuronal pentraxin 2, NPTX2)在胰腺癌組織及胰腺癌患者胰液中均處于高甲基化狀態(tài)[4-5]，但該基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚無報(bào)道。為進(jìn)一步研究NPTX2基因的功能及其在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用，本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NPTX2的人胰腺癌細(xì)胞PANC1，現(xiàn)報(bào)道如下。

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.012

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Emial: zhsli@81890.net