田苗苗, 霍麗娟, 晉 陽

(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化科, 太原 030001)

乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是天然存在的氨基酸 L-半胱氨酸乙?；难苌?是一種極好的巰基供體。一直以來,臨床上主要用于各種呼吸道疾病的治療。但近年來 NAC對肝臟的保護(hù)作用日益受到重視,有研究表明 NAC作為核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的活性抑制劑具有保護(hù)肝細(xì)胞、減輕肝組織病理損害的作用[1]。但對于乙酰半胱氨酸影響酒精性肝損傷時 NF-κB的表達(dá),而對肝臟進(jìn)行有效保護(hù)的報(bào)道尚少見。本文通過研究乙酰半胱氨酸對酒精誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中 NF-κB表達(dá)和TNF-α含量的影響,來評價(jià)其對肝臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性 Wistar大鼠 50只,體重150-200 g,由山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室動物室提供。乙酰半胱氨酸注射液由杭州民生藥業(yè)有限公司提供;56°白酒由北京順鑫牛欄山酒廠生產(chǎn)。血清TNF-α放射免疫試劑盒購于北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;NF-κB p65免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物工程有限公司。全自動雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器由上海核所日環(huán)光電儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 將50只大鼠隨機(jī)分為5組,每組 10只:正常對照組、模型組、乙酰半胱氨酸低劑量組(150 mg/kg)、中劑量組(300 mg/kg)、高劑量組(600 mg/kg)。正常對照組用等劑量的生理鹽水代替酒精灌胃和腹腔注射;模型組以 56°白酒 14 ml/kg體重灌胃,每日一次,連續(xù) 10 d;治療組在酒精灌胃前 30 min分別腹腔注射不同劑量乙酰半胱氨酸,每日一次,連續(xù)10 d。各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間均予普通飲食。

1.2.2 標(biāo)本采集 各組大鼠最后一次給藥后禁食14 h,用 25%烏拉坦腹腔注射麻醉,無菌消毒下打開腹腔,腹主動脈穿刺取血 5 ml,離心分離血清,-20℃保存;留取肝臟標(biāo)本,用 4℃生理鹽水沖洗,濾紙吸干后,以 10%甲醛溶液固定。

1.2.3 血清 TNF-α的測定 采用放射免疫法,由SN-697全自動放射免疫 γ計(jì)數(shù)器測定。

1.2.4 肝組織 NF-κB的測定 采用免疫組化法,具體步驟按 PV兔二步法檢測試劑盒說明書進(jìn)行。全部切片染色按相同條件進(jìn)行。結(jié)果判定:光鏡下觀察,NF-κB細(xì)胞染色呈黃色或棕黃色為陽性,定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì);不染色者為陰性,陰性對照用PBS代替一抗。每張切片隨機(jī)選取 5個高倍鏡視野(40×10),利用 MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析陽性區(qū)域平均光密度值(optical density,OD),以O(shè)D值大小代表陽性產(chǎn)物表達(dá)的多少。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),以xˉ±s表示,方差齊性組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用 LSD法,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在實(shí)驗(yàn)期間,模型組大鼠毛發(fā)光澤度較差,體重增長緩慢,嗜睡。各治療組毛發(fā)光澤度較好,體重增長較快,醒酒后行動敏捷。正常組大鼠全部存活,模型組和中劑量組各有 1只因灌胃時不慎致胃穿孔而死亡,高劑量組有 1只因酒精灌胃誤入氣管而死亡。

2.2 肝組織 NF-κB表達(dá)和血清 TNF-α含量的測定與正常組相比,急性酒精性肝損傷大鼠肝組織中NF-κB的表達(dá)明顯增強(qiáng),血清 TNF-α含量明顯升高(P＜0.01),提示肝臟出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。與模型組比較,乙酰半胱氨酸各劑量組肝組織中 NF-κB的表達(dá)明顯減少,血清 TNF-α含量明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。與乙酰半胱氨酸低劑量組比較,中、高劑量組 NF-κB的表達(dá)減少(P＜0.01),高劑量組TNF-α含量降低(P＜0.01)。與中劑量組比較,高劑量組 NF-κB的表達(dá)減少(P＜0.05),TNF-α含量降低(P＜0.01,見表1)。

表1 各組大鼠肝組織 NF-κB表達(dá)和血清 TNF-α含量的比較 (±s)Tab 1 Comparison of NF-κB expression and serum TNF-αcontent between 5 groups (±s)

表1 各組大鼠肝組織 NF-κB表達(dá)和血清 TNF-α含量的比較 (±s)Tab 1 Comparison of NF-κB expression and serum TNF-αcontent between 5 groups (±s)

與正常組比較,*P＜0.01;與模型組比較,ΔP＜0.01,ΔΔP＜0.05;與 150 mg/kg組比較,□P＜0.01;與 300 mg/kg組比較,#P＜0.01,##P＜0.05

300 9 0.218±0.029*Δ□ 1.72±0.15*Δ 600 9 0.185±0.028Δ□## 1.32±0.12Δ□#

3 討論

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)在我國的發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重危害人們的健康[2]。但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為與酒精的直接毒性作用、氧自由基及內(nèi)毒素?fù)p害、炎性細(xì)胞因子(如 TNF-α、IL-1)釋放等多種因素密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同劑量乙酰半胱氨酸對酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷模型大鼠 NF-κB和TNF-α的影響來探討乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用及機(jī)制。

NF-κB是細(xì)胞中的一個重要轉(zhuǎn)錄因子,具有多向性調(diào)節(jié)作用,能與多種細(xì)胞基因的啟動子和增強(qiáng)子的κB序列位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合,不僅介導(dǎo)多種炎性介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá),也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[3]。生理狀態(tài)下,細(xì)胞中的NF-κB與抑制蛋白 IκB結(jié)合在一起留在細(xì)胞質(zhì)中,處于未活化狀態(tài);當(dāng)細(xì)胞受到外界因素,包括活性氧(ROS)、內(nèi)毒素及各種致炎因子(如 IL-1、IL-6、TNF-α、NO)等[4]刺激時,細(xì)胞內(nèi)的NF-κB激活 ,并與 IκB分離 ,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi) ,啟動多種基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB調(diào)控的基因可以編碼急性反應(yīng)蛋白、趨化因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子等,其中包括腫瘤壞死因子 α和β(TNF-α,β)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)等,這些產(chǎn)物可以直接參與肝臟炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞再生和凋亡等病理生理過程[5]。酒精引起的肝損傷可產(chǎn)生大量的ROS,同時會使內(nèi)毒素水平升高,炎癥介質(zhì)釋放,這些物質(zhì)都可以使 NF-κB活化,進(jìn)而產(chǎn)生大量炎性介質(zhì),發(fā)揮炎性級聯(lián)放大作用,加重肝臟損害。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,與正常組相比,急性酒精性肝損傷大鼠肝組織 NF-κB的表達(dá)明顯增強(qiáng)。

TNF-α是最關(guān)鍵的促炎介質(zhì),對NF-κB的活化起正反饋調(diào)節(jié)作用,它既是 NF-κB的激活物,也是其激活后的產(chǎn)物。TNF-α主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞分泌產(chǎn)生,低濃度的TNF-α是肝細(xì)胞生長分化與再生所必需的調(diào)節(jié)因子,但高濃度的TNF-α既可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,也可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死,是造成肝細(xì)胞損傷的主要因子[6]。越來越多的證據(jù)表明,TNF-α是酒精性肝損傷發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞因子。TNF-α不僅與 ROS中間體及內(nèi)毒素血癥形成正反饋,同時還可激活細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)刺激其他炎癥因子如 IL-1、IL-8等的產(chǎn)生,誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,與正常組相比,急性酒精性肝損傷大鼠血清 TNF-α含量明顯升高,引起炎性損傷。

NAC是一種含巰基的抗氧化劑,對NF-κB的活化和TNF-α的釋放有明顯的抑制作用。其可能的機(jī)制是:①NAC在體內(nèi)脫乙?；笊傻陌腚装彼崾呛铣?GSH的前體,可以促進(jìn) GSH的合成,提高組織內(nèi) GSH含量,防止或調(diào)整氧化還原失平衡,抑制酒精引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧及其衍生物對IκB激酶的激活,從而抑制 NF-κB核易位和TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄。②NAC是一種極好的巰基供體,可提供大量巰基。現(xiàn)已證實(shí),巰基不僅具有抗氧化作用,更為重要的是可調(diào)控 TNF-α等多種基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7],這也是 NAC防治酒精性肝損傷發(fā)生的分子機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,與模型組相比,應(yīng)用乙酰半胱氨酸后,各劑量組肝臟組織中 NF-κB的表達(dá)明顯降低,TNF-α含量明顯減少,且呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。

綜上所述,乙酰半胱氨酸可以通過抑制 NF-κB的激活,減少炎癥因子的釋放,發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用,從而有效防治酒精誘導(dǎo)的肝臟損傷,且其療效隨劑量的增加而加強(qiáng)。

[1] 魏琳琳,陳煜,鄭素軍,等.N-乙酰半胱氨酸對C3A永生化肝細(xì)胞增殖和生物轉(zhuǎn)化功能的影響[J].肝臟,2008,13(1):27-29.

[2] 蘇俊,廖彩仙,周杰,等.酒精性肝病 105例臨床分析[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(5):704-705.

[3] 王春妍,范玉強(qiáng),遲寶榮,等.核因子-κB及其下游因子 TNF-α、Bcl-2在急性肝損傷中的作用及機(jī)制[J].世界華人消化雜志,2008,16(25):2804-2808.

[4] Takahiro W,Hirofumi J,Jiahuai H,etal.Synergistic activation of NF-κBby nontypeable haemophilusinfluenzae and tumor necrosis factor-α[J].PNAS,2004,101(10):3563-3568.

[5] Altavilla D,Saitta A,Squadrito G,etal.Evidence for a role of nuclear factor-kappa B in acute hypovolemic hemorrhagic shock[J].Surgery,2002,131(1):50-58.

[6] 李海燕,李夏,金向群,等.黃芩苷對大鼠慢性酒精性肝損傷的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2008,14(6):58-60.

[7] De Flora S,Izzotti A,D'Agostini F,etal.Mechanism of N-acetylcysteine in the prevention of DNA damageand cancer,with special reference to smoking-related end-points[J].Carcinogenesis,2001,22(7):999-1013.