陳晨，王麗波，曹麗華，邢雪莎，王述森，麻宏偉，羅陽

（中國醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院醫(yī)學基因組學教研室，沈陽 110001；2.附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科，沈陽 110004）

低磷酸酶血癥（hypophosphatasia）是一種罕見的遺傳性疾病，以骨骼和牙齒礦化缺陷，血清和骨堿性磷酸酶活性持續(xù)低水平或缺如為主要特征。目前對本病尚無有效的治療方法。低磷酸酶血癥是由于肝/骨/腎堿性磷酸酶基因（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL；MIM#171760） 突變所致，ALPL基因定位于1p36.1［1］，編碼的蛋白是組織非特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP）。該病的遺傳方式較為復雜，呈常染色體顯性或隱性遺傳。本研究采集了一個低磷酸酶血癥家系中1例低磷酸酶血癥的患兒及其患病母親的血樣，采用PCR結合基因測序的方法尋找患者及其母親的ALPL基因突變位點，進一步確認臨床診斷，同時探討患者發(fā)病的機制。

到漢武帝劉徹即位時，西漢儲備的糧食層層積壓，導致倉庫爆棚；國庫里銅錢積壓太多，導致穿錢的繩子朽壞，銅錢散落無法計算。有錢就任性的劉徹，終于敢對匈奴人說“不”了。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科提供家系成員外周靜脈血及病例資料，系譜圖見圖1。共采集到該家系中Ⅳ-1和Ⅲ-2兩名成員的血樣，先證者Ⅳ-1為2009年就診于盛京醫(yī)院的患者，男，3.5歲，以“腿彎3年”為主訴就診，Ⅲ-2為先證者母親。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查：查體發(fā)現(xiàn)先證者Ⅳ-1身高96.5 cm（-1SD），“O”型腿，雙膝間距5 cm。實驗室檢查中Ⅳ-1血堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）95.5 U/L（參考值40~375 U/L），血鈣、磷、鎂、甲狀旁腺素水平均正常。X線檢查發(fā)現(xiàn)雙側股骨頸干角變小，股骨頸略短，雙側髖內(nèi)翻，見圖2。Ⅲ-2的血ALP為19.5 U/L（參考值40~150 U/L），其他檢查結果正常。

2～5歲兒童的皮膚發(fā)育過程具有一定的特殊性，其皮膚含水比例高， 在不同環(huán)境中的水分喪失速度較快，同時皮膚層內(nèi)的脂質含量偏低，容易受到自身免疫性因子或者外界病原體的感染而出現(xiàn)真皮層的病變[4]。2～5歲兒童的發(fā)病率在不同的年齡階段中處于較高水平[5-6]，部分東部沿海省份的相關流行病學研究顯示，2～5歲兒童不同類型皮膚疾病的總體發(fā)病率占到了其年齡段的第一位[7]。而皮膚病對于2～5歲兒童具有下列幾個方面的主要影響[8-9]：①對于兒童自信心的培養(yǎng)具有較為顯著的影響，增加了患兒自卑或者遠期抑郁及焦慮的風險；②導致患兒對于學習興趣的下降，影響到了其學習成績及自身性格的形成。

1.2.2 提取基因組DNA：取患者Ⅳ-1和Ⅲ-2枸櫞酸鈉抗凝處理的外周靜脈血各200μl，選用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（TaKaRa）試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃保存。

將患者Ⅳ-1的ALPL基因雙向測序結果分別進行序列比對分析（Human BLAT Search，http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat），發(fā)現(xiàn)患兒第12外顯子存在一個雜合突變c.1366G>A（p.G456R），即cDNA第1 366位G突變?yōu)锳，導致456位的甘氨酸變?yōu)榫彼?，見圖3。對患者母親ALPL基因第12外顯子進行測序分析，結果顯示患者母親Ⅲ-2存在相同的雜合突變。

2 結果

1.2.3 PCR擴增候選致病基因ALPL的外顯子并進行測序分析：在UCSC網(wǎng)站獲得ALPL基因的DNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計覆蓋該基因編碼區(qū)（包括外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)）的引物，引物序列見表1。首先對先證者Ⅳ-1進行檢測，PCR擴增該基因的 12個外顯子，PCR反應體系為 2×GC Buffer I （Mg2+Plus）25 μl，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）8 μl，上下游引物終濃度為 0.5 μmol/L，TaKaRa LA Taq 2.5 U，基因組 DNA約 200 ng，加ddH2O至50μl，PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠純化后對PCR產(chǎn)物進行測序分析。測序結果利用UCSC數(shù)據(jù)庫對測得的DNA序列進行核酸序列的同源性比對分析。在先證者基因水平檢測到突變后，同樣通過測序分析方法驗證家系內(nèi)其他患者是否存在相同位點的基因突變。

3 討論

低磷酸酶血癥是一種以骨礦化缺陷和組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP）活性減低為主要特征的遺傳性疾病，目前尚無根治方法，雖然有報道可以用自體間充質干細胞進行基因替代治療［2］，但有效率和安全性尚待確定，因此基因診斷和遺傳咨詢顯得更為重要。低磷酸酶血癥致病基因ALPL定位于1p36.1，共包含12個外顯子，編碼524個氨基酸。參照人類基因突變數(shù)據(jù)庫（Human Gene Mutation Database，HGMD）和國外學者建立的低磷酸酶血癥基因突變數(shù)據(jù)庫（http：//www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），到目前為止共報道了ALPL基因的218個突變，絕大部分為錯義突變，大約占79.3%，且突變主要集中在第5~6外顯子和第9~12外顯子。本研究中檢測到的該家系的p.G456R的雜合突變，位于第12外顯子，Ozono等［3］曾經(jīng)報道過該突變并對其進行體外重組實驗研究，結果顯示p.G456R突變體導致堿性磷酸酶完全失去活性。

在蔡家堡鄉(xiāng)、西山鄉(xiāng)、東山等鄉(xiāng)鎮(zhèn)建立馬鈴薯“青薯2號”“青薯9號”全膜覆蓋栽培技術標準化示范區(qū)80hm2，平均產(chǎn)量3.58×104kg，總產(chǎn)量達286.4×104kg；實現(xiàn)收入3.22萬元·hm-2，總產(chǎn)值257.76萬元(按0.9元/kg計算)；與露地常規(guī)栽培相比，增產(chǎn)0.85×104kg，增產(chǎn)率31.14%，增收0.77萬元·hm-2；新增產(chǎn)量68.0×104kg，新增產(chǎn)值61.2萬元。

ALPL基因編碼的TNAP蛋白共分為4個功能區(qū)域，分別是冠區(qū)、酶激活位點、同源二聚體界面和鈣結合位點，該蛋白通過形成同源二聚體而發(fā)揮活性。第456位的氨基酸靠近TNAP的同源二聚體界面，并且在哺乳動物中是十分保守的氨基酸，該位點由極性疏水性的甘氨酸變?yōu)閴A性的精氨酸，很可能影響TNAP的蛋白結構和活性，因此初步認為p.G456R是該家系中患者疾病表型的關鍵影響因素。根據(jù)患者Ⅳ-1和Ⅲ-2的年齡和生化檢查等臨床表現(xiàn)，兩者在臨床表型上都屬于輕型，輕型低磷酸酶血癥可呈常染色體顯性或隱性遺傳。而在該家系中，根據(jù)系譜圖可知，疾病在該家系中呈常染色體顯性遺傳，這與患者測序分析只檢測到一個雜合基因突變的結果吻合。根據(jù)文獻報道，檢測到一個突變等位基因的輕型低磷酸酶血癥患者多是（76.6%）由于雜合突變的顯性負效應致病［4~6］，而本研究中的p.G456R接近TNAP蛋白同源二聚體界面，因此推斷本家系更可能是由于雜合突變的顯性負效應，即影響了正常二聚體的形成而致病，其具體機制有待進一步研究。

表1 擴增ALPL基因外顯子的引物序列Tab.1 Primer sequence of ALPL gene exons

本研究在中國人群中首次報道了一個低磷酸酶血癥家系ALPL基因編碼區(qū)的雜合錯義突變c.1366G>A，進一步豐富了基因突變數(shù)據(jù)庫，有助于深入了解該基因的結構與功能，同時也確認了患者的臨床診斷，為該家庭的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了可靠的依據(jù)。

［1］Mornet E.Hypophosphatasia［J］.Orphanet JRare Dis，2007，2：40-47.

［2］Katsube Y，Kotobuki N，Tadokoro M，et al.Restoration of cellular function of mesenchymal stem cells from a hypophosphatasia patient［J］.Gene Ther，2010，17（4）：494-502.

［3］Ozono K，Yamagata M，Michigami T，et al.Identification of novel missense mutations（Phe310Leu and Gly439Arg）in a neonatal case ofhypophosphatasia［J］.JClin Endocrinol Metab，1996，81（12）：4458-4461.

［4］Delphine F，Isabelle B，Anne-Sophie L，et al.Mild forms of hypophosphatasia mostly result from dominant negative effect of severe allelesor fromcompound heterozygosity for severeand moderatealleles［J］.BMCMed Genet，2009，6（10）：51-59.

［5］Muller HL，Yamazaki M，Michigami T，et al.Asp361Val mutant of alkaline phosphatase found in patients with dominantly inherited hypophosphatasiainhibitstheactivityof thewild-typeenzyme［J］.JClin Endocrinol Metab，2000，85（2）：743-747.

［6］Lia-Baldini AS，Muller F，Taillandier A，et al.A molecular approach todominancein hypophosphatasia［J］.Hum Genet，2001，109（1）：99-108.