趙俊仁，孔保華

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，湖北黃岡438000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

自然發(fā)酵風(fēng)干腸中乳酸菌的分離與鑒定

趙俊仁1，2，孔保華2，*

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，湖北黃岡438000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

以自然發(fā)酵風(fēng)干腸為研究對(duì)象，分析了細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌菌數(shù)的變化情況，結(jié)果表明，乳酸菌為風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群。通過(guò)對(duì)風(fēng)干腸中乳酸菌的分離鑒定，共分離出戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp lactis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）5株乳酸菌。24h產(chǎn)酸速率測(cè)定結(jié)果表明，彎曲乳桿菌＞短乳桿菌＞乳酸乳球菌乳酸亞種＞戊糖片球菌＞發(fā)酵乳桿菌。

發(fā)酵風(fēng)干腸，乳酸菌，分離，鑒定

風(fēng)干腸是我國(guó)北方地區(qū)具有傳統(tǒng)特色的發(fā)酵肉制品，其特點(diǎn)是水分含量低、貯存期長(zhǎng)、賦有特殊質(zhì)地和風(fēng)味，深受廣大群眾的喜愛(ài)。自然發(fā)酵風(fēng)干腸內(nèi)部的微生物包括原料中固有的和環(huán)境中后污染的菌群，乳酸菌是發(fā)酵肉制品在自然發(fā)酵過(guò)程中最易生長(zhǎng)的微生物區(qū)系。有研究表明乳酸菌能促使亞硝酸鹽分解，減少產(chǎn)品中殘留的亞硝胺［1-2］；同時(shí)抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病菌的生長(zhǎng)［3-4］。乳酸菌對(duì)人體的主要作用是調(diào)整腸道環(huán)境，即乳酸菌將乳糖分解為乳酸，使腸道形成酸性環(huán)境；同時(shí)具有賦予產(chǎn)品優(yōu)良感官性，豐富的營(yíng)養(yǎng)性和提供安全性的優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外早在上世紀(jì)20年代就使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)。Rantsiou等人從三種歐式發(fā)酵香腸中分離出彎曲乳桿菌、植物乳桿菌和清酒乳桿菌［5］。有研究者從意大利發(fā)酵香腸中分離出465株乳酸菌［6］。Greco等人從傳統(tǒng)歐式干發(fā)酵香腸中分離出112株乳酸菌［7］。本研究旨在通過(guò)對(duì)自然發(fā)酵風(fēng)干腸內(nèi)部乳酸菌的分離鑒定，獲得快速產(chǎn)酸的菌株，為肉用復(fù)合發(fā)酵劑的制備提供優(yōu)良的微生物菌株，以達(dá)到提高生產(chǎn)速率、穩(wěn)定生產(chǎn)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉 宰后6h的新鮮豬臀肉、里脊肉及背脂（4℃保存），購(gòu)于北大荒肉業(yè)；腸衣 豬小腸衣；白砂糖、食鹽、姜、淀粉、調(diào)味料等 均由市場(chǎng)購(gòu)得；微生物生化鑒定管 杭州天和試劑公司；亞硝酸鈉，NaCl，乙酸鈉，吐溫-80，CaCO3，乙醇，甲基紅，二甲基氨基苯甲醛，KOH，對(duì)氨基苯磺酸等，MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，肉腸模擬培養(yǎng)基，產(chǎn)H2S培養(yǎng)基，產(chǎn)H2O2檢測(cè)用培養(yǎng)基，硝酸鹽還原培養(yǎng)基、產(chǎn)氨培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、精氨酸水解培養(yǎng)基、胰蛋白胨水培養(yǎng)基等。

XSZ-G型顯微鏡 OLYMPUS公司；DH5000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；pHS-25型pH計(jì) 上海精科雷磁儀器廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

表2 分離乳酸菌的菌體形態(tài)特征

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 風(fēng)干腸制作 將原料肉（瘦肉與肥肉比例為9∶1）加入食鹽和亞硝酸鹽后腌制24h，絞碎，肥肉切?。患尤胝{(diào)味料拌餡，灌腸，風(fēng)干7～10d。

1.2.2 菌數(shù)測(cè)定 按發(fā)酵時(shí)間0～10d，每天取樣，每份樣品5.0g，樣品無(wú)菌剝?nèi)ツc衣后剪碎研磨，加入45mL生理鹽水中，4℃下平衡20min。采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，將平衡好的樣品梯度稀釋，按發(fā)酵天數(shù)，適當(dāng)選取2～3個(gè)稀釋度進(jìn)行涂布，在35℃下培養(yǎng)48h分別測(cè)定總菌數(shù)與乳酸菌菌數(shù)。

1.2.3 乳酸菌的分離 在MRS固體培養(yǎng)基中，選取溶CaCO3圈較大的幾株優(yōu)勢(shì)菌株劃線分離，直到得到純菌株。純化后的菌株分別接種到MRS斜面培養(yǎng)基，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化后的菌株涂布到MRS固體培養(yǎng)基上，35℃下培養(yǎng)24h，觀察菌落特征，取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化實(shí)驗(yàn) 對(duì)分離后的菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)粘性實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)吲哚實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)和精氨酸水解實(shí)驗(yàn)；用半固體培養(yǎng)基測(cè)定菌株的運(yùn)動(dòng)性。

1.2.4.3 耐鹽實(shí)驗(yàn)與耐亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn) 將分離菌株分別接種到含有 4%和 6%NaCl以及 150mg/kg NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，于35℃下培養(yǎng)24h，以不接菌的MRS培養(yǎng)基作空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)于600nm下，測(cè)定OD值，比較生長(zhǎng)情況。

1.2.4.4 糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 通過(guò)菌株的糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)分離菌株對(duì)各種糖醇類碳源的利用情況。

1.2.5 蛋白酶和脂肪酶活性實(shí)驗(yàn) 采用添加15%脫脂乳的MRS固體培養(yǎng)基，分別滴入0.1mL的菌液涂布均勻，35℃培養(yǎng)24h。當(dāng)牛乳中的酪蛋白被分解后，菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明環(huán)，以此判定菌種有無(wú)分解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。采用添加15%豬油和中性紅指示劑的MRS固體培養(yǎng)基，分別滴入0.1mL的菌液涂布均勻，35℃培養(yǎng)24h。當(dāng)菌種分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時(shí)，培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。

1.2.6 乳酸菌產(chǎn)酸速率的測(cè)定 在模擬肉腸培養(yǎng)基中，分別接入分離菌株，在35℃下培養(yǎng)，并測(cè)定24h內(nèi)的pH變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)為三次測(cè)定值的平均值。使用Sigmaplot 9.0（畫(huà)圖軟件）作圖，使用Statistix8.1（分析軟件，St Paul，MN）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 自然發(fā)酵風(fēng)干腸中總菌數(shù)與乳酸菌菌數(shù)的變化情況

自然發(fā)酵風(fēng)干腸內(nèi)部微生物變化極其復(fù)雜，多數(shù)研究表明乳酸菌為發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群，并在發(fā)酵過(guò)程中起到降低 pH的作用［8］。圖1表明，1～2d內(nèi)總菌數(shù)與乳酸菌菌數(shù)顯著上升（P＜0.05），由此推斷總菌數(shù)的升高主要由乳酸菌的大量繁殖所導(dǎo)致。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌始終為風(fēng)干腸內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，控制發(fā)酵過(guò)程。

圖1 自然發(fā)酵風(fēng)干腸中總菌數(shù)及乳酸菌菌數(shù)的變化情況

2.2 乳酸菌的鑒定結(jié)果

通過(guò)各鑒定實(shí)驗(yàn)，從自然發(fā)酵風(fēng)干腸中共分離篩選得到5株乳酸菌，分別編號(hào)為L(zhǎng)1、L2、L4、L5和L6，基本情況及發(fā)酵特性如下。

2.2.1 乳酸菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 對(duì)分離菌株的菌落的大小、顏色、透明度、致密度、邊緣整齊度以及表面光滑程度等指標(biāo)進(jìn)行分析。由表1可以看出，自然發(fā)酵風(fēng)干腸中的乳酸菌多數(shù)為（灰）白色，菌落表面光滑，邊緣整齊，菌落多數(shù)不透明。乳酸菌菌體形態(tài)見(jiàn)表2與圖2，均為革蘭氏陽(yáng)性菌G+；排列方式各不相同，成對(duì)、四聯(lián)、短鏈或并排鏈狀排列。

表1 分離乳酸菌的菌落形態(tài)特征

2.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果 乳酸菌的生理生化反應(yīng)與糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。各分離乳酸菌均不具有運(yùn)動(dòng)性、不產(chǎn)粘液、不產(chǎn)硫化

圖2 分離乳酸菌菌體形態(tài)圖

表3 乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果

表4 乳酸菌糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)菌體和菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定學(xué)手冊(cè)》［9］和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》［10］對(duì)菌株進(jìn)行鑒定分析。鑒定結(jié)果為：L1為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；L2為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp lactis）；L4為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；L5為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）；L6為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

2.3 乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪降解能力的測(cè)定

分離5株乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。發(fā)酵肉制品中的乳酸菌如果具有蛋白質(zhì)降解活性，則可能降低產(chǎn)品的貨架期，引起腐敗現(xiàn)象；同樣，具有脂肪降解活性的乳酸菌會(huì)使產(chǎn)品在儲(chǔ)存銷售過(guò)程中出現(xiàn)酸敗味，影響產(chǎn)品質(zhì)量［11］。由表5可知，各株分離乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪均無(wú)降解作用，可作為肉用發(fā)酵劑使用。

2.4 乳酸菌菌株24h內(nèi)產(chǎn)酸能力測(cè)定

產(chǎn)酸速率是衡量乳酸菌發(fā)酵劑品質(zhì)的重要指標(biāo)之一?？焖佼a(chǎn)酸可縮短生產(chǎn)周期，并使乳酸菌迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群，抑制其它有害菌及致病菌的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品的生物安全性。由圖3可見(jiàn)，5株乳酸菌在前3h的pH均呈快速下降趨勢(shì)，無(wú)顯著差異；6h后，各菌株的pH下降表現(xiàn)出差異性（P＜0.05）。其中，L6下降最緩慢，L5和L1下降最快速。前9h為乳酸菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在此期間乳酸菌大量繁殖，導(dǎo)致pH的迅速下降，基本達(dá)到5.0以下。9h后，pH呈小幅度下降，乳酸菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。可見(jiàn)，24h內(nèi)，L6的產(chǎn)酸能力最弱，其他四株乳酸菌相對(duì)較強(qiáng)。

圖3 乳酸菌菌株24h內(nèi)pH的變化情況

3 結(jié)論

自然風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌群，控制發(fā)酵過(guò)程，對(duì)自然發(fā)酵風(fēng)干腸中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，得到5株乳酸菌，分別為戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、短乳桿菌、彎曲乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，其中彎曲乳桿菌產(chǎn)酸最快速。該結(jié)果豐富了我國(guó)發(fā)酵肉制品中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的種類，為發(fā)酵肉制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更多的菌種選擇。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from the Chinese-style naturally dry fermented sausages

ZHAO Jun-ren1，2，KONG Bao-hua2，*
（1.College of Life Science and Engineering，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The Chinese-style naturally dry fermented sausages were used for this study.The changes of the number of total bacteria and lactic acid bacteria during the process were analyzed.The lactic acid bacteria were predominant microorganism.Lactic acid bacteria included 5 species，there were Pediococcus pentosaceus，Lactococcus lactis subsp lactis，Lactobacillus fermentum，Lactobacillus curvatus and Lactobacillus brevis.The acidifying rate were studied，the results showed that Lactobacillus curvatus＞Lactobacillu brevis＞Lactococcus lactis sub lactis＞Pediococcus pentosaceus＞Lactobacillus fermentum.

naturally dry fermented sausages；lactic acid bacteria；isolation；identification

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0158-04

2010-04-19 *通訊聯(lián)系人

趙俊仁（1980-），女，講師，博士，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（200903012-02）；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃優(yōu)秀中青年人才項(xiàng)目（08BQ099）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助（CXZ011-01）。