林燕如，周燕芳，林潮奕

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州521041）

14種潮汕植物中總黃酮的提取及其自由基清除率的測定

林燕如，周燕芳，林潮奕

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州521041）

對14種常見的潮汕植物進(jìn)行了總黃酮的提取，并研究了這些植物對羥基自由基的清除能力。提取過程主要采取了兩種方法：傳統(tǒng)的溫水浸提法和微波乙醇法。結(jié)果表明，微波乙醇法對這些常見的植物中總黃酮的提取效率比較高，這些植物的黃酮提取液對羥基自由基的清除能力比較強(qiáng)，而且與濃度存在線性關(guān)系，為潮汕植物的進(jìn)一步研究和合理利用提供了理論依據(jù)。

潮汕植物，總黃酮，羥自由基

黃酮類化合物具有多種生物活性，包括降血脂、清除自由基、抗氧化、抗衰老等。近年來世界上掀起了黃酮類化合物的研究熱潮，以期為黃酮類化合物在醫(yī)藥、保健食品、化妝品等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。由于黃酮類化合物廣泛存在于藥用植物中，更是目前植物藥開發(fā)的重要寶庫，為研制一、二類新藥提供了先導(dǎo)來源［1］。潮汕地區(qū)氣候?qū)贃|南亞熱帶海洋性氣候，一年四季受季風(fēng)影響，陽光充足，雨量充沛，土壤類型復(fù)雜多樣，復(fù)雜的地理因素以及山、海、平原兼?zhèn)涞膬?yōu)越自然條件使得潮汕植物資源極其豐富，有藥用植物228科903屬1599種73變種［2］。因潮汕地區(qū)氣候濕熱，人們對潮汕常用的藥用植物的開發(fā)利用有自己的一套方法。一年四季都有青草藥可服用。大街小巷中可看各種“涼茶鋪”。潮汕常用的藥用植物中黃酮的含量都較大，是富含黃酮類物質(zhì)的極好植物資源。故此開展對潮汕地區(qū)常見的14種藥用植物資源中總黃酮的提取并對比其對羥自由基的清除作用，對開發(fā)潮汕植物的藥用價(jià)值、藥用原理提供了科學(xué)根據(jù)，為中草藥生產(chǎn)和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 購于潮州市區(qū)中草藥市場；蘆丁對照品生化試劑，上海試劑二廠；食用酒精、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫 均為分析純。

組織搗碎機(jī)，HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；722N可見分光光度計(jì)，F(xiàn)A2004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHD-III循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；800臺式離心機(jī) 上海手術(shù)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前期處理 干燥→粉碎→60℃烘干→裝入試劑瓶→放于干燥器中

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［3］精確稱取經(jīng)120℃烘至恒重的蘆丁對照品50mg，用60%乙醇溶解并定容至50mL，得濃度為1.0mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5mL溶液于50mL容量瓶用60%乙醇稀釋至刻度，得濃度為0.1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取濃度為0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5mL于10mL刻度試管中，加入60%乙醇至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL振搖后放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，振搖后放置6min后，加入4%的氫氧化鈉溶液2mL，用60%乙醇定容至刻度靜置15min，以取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液10mL為空白對照，搖勻后，在510nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程為：A= 0.9440C-0.0063，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9970，線性范圍為：0.100～0.500mg/mL。

1.2.3 樣品總黃酮的提取

橋形圖適合用于對化學(xué)知識進(jìn)行類比推理 初中化學(xué)的內(nèi)容有大量的方程式需要學(xué)生掌握記憶，而且多數(shù)方程式都有一定的相似度。如在化學(xué)測試中，經(jīng)常會出現(xiàn)根據(jù)已知的化學(xué)方程式，讓學(xué)生寫出未知的化學(xué)方程式，這不僅需要學(xué)生平時(shí)學(xué)習(xí)積累，也需要一定的類比推理能力，才不至于嚴(yán)重失分。所以，在初中化學(xué)學(xué)習(xí)階段，需要養(yǎng)成對化學(xué)知識進(jìn)行類比推理的本領(lǐng)，學(xué)習(xí)新知識以后，跟原來舊知識進(jìn)行比較，掌握其中相似的屬性。學(xué)會類比推理，對學(xué)生的化學(xué)預(yù)習(xí)或復(fù)習(xí)環(huán)節(jié)都有很大的促進(jìn)作用。

1.2.3.1 傳統(tǒng)溫水浸提法 準(zhǔn)確稱取1.000g樣品于50mL錐形瓶中，加入30mL蒸餾水，放入80℃恒溫水浴鍋水浴1h，取出后減壓抽濾，濾液冷卻至室溫后加水定容至50mL，取10mL溶液離心15min，上層清液備測。

1.2.3.2 微波乙醇法［4］準(zhǔn)確稱取1.000g樣品于50mL錐形瓶中，加入適量的蒸餾水浸沒，蓋上保鮮膜放入微波爐，功率800W，火力40%下微波3min，取出加入60%乙醇30mL，并在溫度為80℃的恒溫水浴鍋水浴1h，取出后減壓抽濾，濾液冷卻至室溫后加60%乙醇定容至50mL，取10mL溶液離心15min，上層清液備測。

1.2.3.3 總黃酮含量的測定 準(zhǔn)確量取適量樣品液（確保其測出濃度在線性范圍內(nèi)）于50mL容量瓶中，加入60%乙醇至5mL，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL振搖后放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，振搖后放置6min，后加入4%的氫氧化鈉溶液2mL，用60%乙醇定容至刻度靜置15min，同時(shí)作試劑空白，以試劑空白作對照，于510nm波長處測定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，而后計(jì)算出樣品中總黃酮含量（以mg/g計(jì)算）。

式中：C為樣液含黃酮量，mg；V1為定容體積，mL；V2為顯色反應(yīng)定容體積，mL；V3為顯色反應(yīng)測定取用樣液體積，mL；W為稱樣量，g。

1.2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 任取三種潮汕植物的微波提取液進(jìn)行回收率的測定，每種各取三份分別加入0.50、0.75、1.00mL的0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.3.3法進(jìn)行測定。

回收率（%）=加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液后所測得的黃酮含量/（樣品液黃酮含量+加入蘆丁量）×100%

1.2.5 對羥基自由基清除率的測定

1.2.5.1 羥基自由基生成體系 參照Fenton反應(yīng)的方法建立·OH自由基產(chǎn)生體系模型［5］。H2O2與二價(jià)鐵離子混合后產(chǎn)生OH·的Fenton反應(yīng)為：H2O2+ Fe2+=OH-+OH·+Fe3+，·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，但在反應(yīng)體系中加入水楊酸，能有效地捕捉·OH并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收；若加入具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在510nm處測量含被測物反應(yīng)的吸光度，并與空白液比較，便能測定被測物對·OH的清除作用。

1.2.5.2 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn) 取5根50mL比色管，依次加入2mmol/L FeSO43mL，1mmol/L H2O23mL，搖勻，接著加入6mmol/L水楊酸3mL，搖勻，在37℃下水浴恒溫15min后取出，在510nm處測其吸光度值為A0（空白），然后分別往5根比色管中加0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的各樣品的乙醇提取液，再分別加0.8，0.6，0.4，0.2，0.0mL蒸餾水，搖勻，再在37℃下水浴恒溫15min后取出，測得的吸光度值為Ax［5-6］。平行測2～3次，使用公式進(jìn)行計(jì)算即可得清除率。

式中，A0、Ax分別表示空白液和被測液反應(yīng)后的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種提取方法的比較

從表1不難看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微波乙醇法對這些常見的植物中黃酮類物質(zhì)的提取效率都較傳統(tǒng)溫水浸提法高，這主要是黃酮類化合物包括水溶性黃酮（如黃酮甙）和水不溶性黃酮（如黃酮生物堿）兩大類。乙醇可以廣泛地溶解各種黃酮。因此，在總黃酮的分析測定宜用乙醇提取法。微波可以強(qiáng)化乙醇浸提法，達(dá)到省時(shí)、高效、節(jié)能的目的。此方法采用全物理過程，無任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 潮汕地區(qū)民間常用植物［7］總黃酮含量

2.2 潮汕地區(qū)常見植物黃酮含量

表1的結(jié)果表明，14種常見的潮汕植物中均含有黃酮類物質(zhì)，植物種類不同，其中黃酮含量也不同，在以上14種植物中總黃酮含量在10mg/g以上的植物就有12種，含量在20mg/g以上的植物有10種，而含量在40mg/g以上的有4種，說明潮汕地區(qū)民間常用的植物中黃酮含量均較高。在被研究的14種植物中，金毛狗的黃酮含量最高，其次是薄荷，再者是蕺菜和野菊花，這些都是民間比較常用的藥用植物，說明潮汕地區(qū)擁有較好的藥用植物資源［7］。

表2 回收率的計(jì)算

表3 14種常見的潮汕植物對羥基自由基的清除率（%）

2.3 樣品的回收率

由表2可得3種任選的植物的回收率的測定結(jié)果在95.41%～105.63%范圍內(nèi)，平均回收率分別為100.12%、100.26%、101.30%。回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測定黃酮含量所采用的分光光度法準(zhǔn)確度較高，偏差較小，條件容易控制，簡單方便，是測定植物中總黃酮含量的一種容易操作、切實(shí)可行的方法。

2.4 對羥基自由基的清除能力

14種常見的潮汕植物乙醇提取液對羥基自由基的清除能力數(shù)據(jù)如表3所示。

由表3可以看出，37℃下各種常見的植物對羥自由基都有明顯的清除作用，而且相同條件下各種植物不同濃度的提取液清除的能力各有不同，同種提取液對羥自由基的清除能力與其濃度呈良好線性關(guān)系，呈隨濃度的增大而增大的趨勢。當(dāng)都加入1mL乙醇提取液時(shí)，清除率最高的是金毛狗提取液（44.57%），其次是薄荷（42.57%），再次是蕺菜（40.86%）。結(jié)合表3和表1的對比，可以看出各植物乙醇提取液對羥基自由基的清除能力跟各植物中黃酮含量相關(guān)，而且成正比的關(guān)系。

3 結(jié)論

3.1 微波乙醇法對14種常見的潮汕植物中黃酮類物質(zhì)的提取效率都較傳統(tǒng)溫水浸提法高。

3.2 14種常見的潮汕植物中均含有黃酮類物質(zhì)，植物種類不同，其中黃酮含量也不同。在被研究的14種植物中，金毛狗的黃酮含量是最高，其次是薄荷，再者是蕺菜和野菊花。

3.3 37℃下14種常見的潮汕植物對羥自由基都有明顯的清除作用，而且相同條件下各種植物不同濃度的提取液清除的能力各有不同，同種提取液對羥自由基的清除能力與其濃度呈良好線性關(guān)系，對羥自由基清除率呈隨濃度的增大而增大的趨勢。

［1］黃愛玲.黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（10）：71-72.

［2］吳修仁.廣東汕頭地區(qū)藥用植物資源及其保護(hù)與利用［J］.韓山師專學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1988（9）：124-134.

［3］丁利君，周燕芳，林楠.溪黃草中黃酮類物質(zhì)提取及對羥自由基清除作用［J］.食品與機(jī)械，2004，20（3）：13-14.

［4］丁利君.微波輔助萃取半邊旗黃酮的工藝優(yōu)化及其抗氧化研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：803-806.

［5］李貴榮，楊勝圓.黨參多糖的提取及其對活性氧自由基的清除作用［J］.化學(xué)世界，2001（8）：421-422.

［6］林燕如，丁利君.鐵線蕨中總黃酮的提取及其自由基清除率的測定［J］.食品與機(jī)械，2008，24（5）：63-66.

［7］吳修仁.潮汕植物志要［M］.廣東省汕頭市：廣東省汕頭市生物學(xué)會，1993：9-114.

Extraction and determination of clearance rate of hydroxyl radicals of flavonoid from 14 kinds of common Chaoshan plants

LIN Yan-ru，ZHOU Yan-fang，LIN Chao-yi
（Department of Chemistry，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China）

The total flavonoids extraction of 14 kinds of common Chaoshan plants were carried on and these plants on the hydroxyl free radical elimination ability were studied.Two main methods traditional warm water extraction and microwave ethyl alcohol extraction were used in the extraction process.The results indicated that the yield of flavonoids by microwave ethyl alcohol extraction was higher than that of the traditional warm water extraction.The total flavonoid extract from these plants had good scavenging effect on hydroxyl free radical，and had the linear relations.The results will provide new scientific evidence for further studies.

Chaoshan plant；total flavonoids；hydroxyl free radical

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0124-03

2009-10-29

林燕如（1982-），女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品化學(xué)。

韓山師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（LQ200812）。