陳 靜 ，趙豐麗，周巧勁

（廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

柿葉揮發(fā)油抑菌活性的研究

陳 靜 ，趙豐麗，周巧勁

（廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

采用水蒸氣蒸餾法提取柿葉揮發(fā)油，并用濾紙片法研究柿葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌活性和最低抑菌濃度. 結(jié)果表明，柿葉揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)大腸桿菌抑制作用較弱，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為3.13μL/m L、3.13μL/m L和25.00μL/m L. 柿葉揮發(fā)油較好的抗微生物活性表明它可能是一種較好的臨床抗菌藥物.

柿葉揮發(fā)油；抑菌活性；最低抑菌濃度

柿葉為雙子葉柿樹科柿樹屬柿(Diospyros kaki L. f.)的葉. 柿樹為常綠或落葉喬木或灌木，主要生長在熱帶和溫帶，約有6屬450種，其中我國有柿樹2屬50多種，栽培面積約2.0×105hm2，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上，是世界上最主要的柿樹生產(chǎn)國. 柿樹在我國已有2 000多年的栽培歷史，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一. 柿葉中含有豐富的維生素C、黃酮、蘆丁、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對(duì)人體有益的營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用. 目前，我國柿葉開發(fā)的產(chǎn)品種類較少，品質(zhì)低. 最成功的是在柿葉茶制備技術(shù)的研究上. 關(guān)于柿葉化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，其揮發(fā)性成分的研究國內(nèi)外更少有報(bào)道，而且主要集中在揮發(fā)油提取工藝和化學(xué)成分分析研究上[1-5]，而對(duì)其抗菌活性的研究幾乎未見報(bào)道. 通常植物中所含的精油都具有良好的抗蟲、抑菌生物活性[6]. 本試驗(yàn)通過水蒸氣蒸餾法提取柿葉揮發(fā)油，并采用濾紙片法對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了研究，旨在為充分利用我國柿葉資源，進(jìn)一步研究和開發(fā)柿葉精油提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 柿葉

5月初至7月的新鮮柿葉，采自桂林市郊區(qū).

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis). 廣西師范大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.3 主要試劑

石油醚(沸程30~60℃℃)、乙醚、無水硫酸鈉、氯化鈉等均為分析純.

1.1.4 主要儀器

水蒸氣蒸餾裝置(自組裝)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA 中國上海亞榮儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B95中國鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；電子天平(BL12德國賽多利公司)；手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-SG41-280B中國上海華線設(shè)備公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CY-2F中國上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；生化培養(yǎng)箱(HP400S中國武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)；光學(xué)顯微鏡(YS100日本尼康公司).

1.2 方法

1.2.1 柿葉揮發(fā)油的提取

采用水蒸氣蒸餾法，選用無蟲無銹斑的新鮮柿葉，洗凈、切碎，取500g放入3000m L燒瓶內(nèi)，加水至1/2高處(約為1500m l)使柿葉完全浸透后進(jìn)行蒸餾，蒸至溜出物無味為止. 蒸溜物中加入石油醚萃取三次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉除去萃取液中的水，過濾，減壓濃縮除去石油醚得到黃綠色透明油狀物，有較濃的清香味，即為柿葉揮發(fā)油. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)多次提取以制得足夠量的柿葉揮發(fā)油，然后將制得的柿葉揮發(fā)油密閉保存，備用.

1.2.2 柿葉揮發(fā)油的抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1 培養(yǎng)基的制備

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂20g，氯化鈉5g，水1000m L，調(diào)pH7.0~pH7.2，121℃，滅菌20m in備用.

1.2.2.2 菌懸液的制備

將三種供試菌活化，然后將一種菌挑取少量放入裝有10m L無菌水的試管中，充分混合，制成菌懸液，用無菌吸管取1m L充分混合的菌懸液于另一支裝有9m L無菌水的試管中，如此成10倍地稀釋，依次制成系列濃度的菌懸液，按照同樣的方法將另兩種菌也依次制成系列濃度的菌懸液，采用平板記數(shù)法調(diào)至濃度為106~ 107個(gè)/m L的菌懸液，備用.

1.2.2.3 抑菌活性的測定(濾紙片法)

選用吸水力較強(qiáng)而質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔器打成直徑為6mm的圓形濾紙片，置干燥干凈的培養(yǎng)皿中滅菌后備用. 將制得的柿葉揮發(fā)油以乙醚為溶劑配制成200.00μL/m L的待測液，取已滅菌的圓形濾紙片浸泡在待測液中30m in. 將融化的滅菌培養(yǎng)基傾入無菌培養(yǎng)皿中待凝固后將各種待測菌懸液各取0.3m L在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上均勻涂布，制成含菌平板，用無菌鑷子取浸泡過柿葉揮發(fā)油待測液的濾紙片，瀝干后貼在含菌平板上，輕壓一下，使其牢固. 每皿放三片，其中一片為只浸有乙醚的濾紙片做為對(duì)照，另外兩片為浸泡過200μL/m L待測液的濾紙片，每種菌做兩個(gè)平皿，然后置于培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h后測定抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值[7-12].

1.2.2.4 最低抑菌濃度的測定

能夠完全抑制某真菌或細(xì)菌生長的最低濃度為該菌種的最低抑菌濃度(M IC)[13]. 根據(jù)濾紙片法所得的結(jié)果，采用2倍連續(xù)梯度稀釋，以乙醚為溶劑將200.00μL/m L柿葉揮發(fā)油溶液依次配制成100.00μL/m L，50.00μL/m L，25.00μL/m L，12.50μL/m L，6.25μL/m L，3.13μL/m L，1.56μL/m L，0.78μL/m L，0.39μL/m L和0.19μL/m L的10種濃度梯度試樣液，將滅菌后的濾紙片分別浸泡在10不同濃度的揮發(fā)油試樣液中30min. 將三種待測菌懸液各取0.3m L在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上均勻涂布，制成含菌平板，然后將在10種濃度稀釋液中浸泡好的濾紙片取出瀝干貼在含菌平板上，輕壓一下使其牢固，每皿貼三片，其中一片為乙醚對(duì)照，每種濃度每種菌做兩個(gè)平皿，然后倒置于培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24h后觀察現(xiàn)象，出現(xiàn)抑菌圈的最低藥物濃度即為MIC值[14].

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.2.3 抑菌活性的測定方法(濾紙片法)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表1.

表1 抑菌活性測定結(jié)果

表1結(jié)果顯示，200.00μL/m L的柿葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均具有抑制作用. 其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用次之，其抑菌圈平均直徑分別為18.5mm和15.5mm；而對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱，其抑菌圈直徑為9.2mm.

2.2 M IC試驗(yàn)結(jié)果

由抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果可以看出柿葉揮發(fā)油對(duì)三種供試菌都有抑菌效果，為進(jìn)一步證實(shí)其抑菌活性，按照1.2.2.4最低抑菌濃度的測定方法，測定柿葉揮發(fā)油對(duì)三種供試菌的最低抑制菌濃度，試驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 M IC測定結(jié)果

表2結(jié)果顯示，柿葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的M IC為25.00μL/m L，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的M IC都為3.13μL/m L. M IC試驗(yàn)結(jié)果說明，柿葉揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，在其濃度為3.13μL/m L時(shí)有抑制圈出現(xiàn)，即具有抑制作用；而對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱，在其濃度為25.00μL/m L時(shí)有抑制圈，而當(dāng)濃度為12.50μL/m L時(shí)已不出現(xiàn)抑制圈，即已不具有抑制作用.

3 結(jié)語

柿葉揮發(fā)油抑菌試驗(yàn)表明，柿葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均具有抑制作用，

特別是對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用，在其最低抑菌濃度為3.13μL/m L時(shí)仍具有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱，其最低抑菌濃度為25.00μL/m L. 由于柿葉揮發(fā)油提取率較低，制得的柿葉揮發(fā)油量很少，所以本試驗(yàn)只對(duì)文中三種供試菌的抑菌活性做了研究，而對(duì)其他細(xì)菌和真菌的抑菌活性還有待進(jìn)一步研究. 柿葉揮發(fā)油較好的抗微生物活性表明它可能是一種較好的臨床抗菌藥物. 根據(jù)文獻(xiàn)[1]可知，柿葉揮發(fā)油的成分多為烯醇和烯醛類，推測其抑菌作用可能與其抗氧化活性具有密切聯(lián)系，

具體抑菌機(jī)理還有待研究. 目前抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重，尋找新的天然抗菌藥物迫在眉睫，而我國柿葉資源豐富，大力開發(fā)柿葉精油衛(wèi)生、保鮮應(yīng)用產(chǎn)品前景良好.

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Antim icrobial Activities of Volatile Oil from Persimmon Leaves

CHEN Jing, ZHAO Feng-li, ZHOU Qiao-jin
(College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)

The volatile oil was extracted from persimmon leaves by water steam distillation. Its antimicrobial activities and the m inimum inhibitory concentration(M IC)to Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Escherichia coli were investigated by the filter paper method. The result showed that the volatile oil from persimmon leaves had powerful inhibitory effects against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis, but it had weak inhibitory effects against Escherichia coli. The M IC to Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Escherichia coli were: 3.13 μL/m L, 3.13 μL/m L and 25.00 μL/m L, respectively.

Persimmon leaves volatile oil; Antim icrobial activities; M inimum inhibitory concentration (M IC)

Q949.96

A

1009-2854(2010)11-0034-03

(責(zé)任編輯：徐 杰)

2010-09-22

陳 靜(1980— ), 女, 湖北襄樊人, 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院助教.