周穩(wěn)穩(wěn) 廉 潔 胡科家 高云華 徐 百

(1中國科學院理化技術(shù)研究所光化學轉(zhuǎn)換和功能材料重點實驗室,北京 100190; 2中國科學院研究生院,北京 100049)

硅基芯片表面化學性質(zhì)對蛋白質(zhì)固定化的影響

周穩(wěn)穩(wěn)1,2廉 潔1,2胡科家1,2高云華1,*徐 百1,*

(1中國科學院理化技術(shù)研究所光化學轉(zhuǎn)換和功能材料重點實驗室,北京 100190;2中國科學院研究生院,北京 100049)

制備蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵在于將蛋白質(zhì)固定到芯片表面并保持其生物學活性.本實驗中,我們分別采用物理吸附、直接化學固定、加入間隔臂化學固定和生物親和作用固定的方法將癌胚抗原(CEA)抗體固定到硅基芯片的二氧化硅表面.基于抗原-抗體的特異性相互作用,利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)評價各種方法固定抗體的效果.實驗結(jié)果表明,在修飾有氨基的表面采用戊二醛作為偶聯(lián)試劑固定CEA抗體具有最高的偶聯(lián)效率,引入多聚賴氨酸(poly-L-lysine)作為間隔臂可以顯著增強固定效果,并可進一步降低非特異性吸附.而利用生物親和作用固定CEA抗體也可獲得較好的固定效果,但是非特異性吸附較嚴重.

蛋白質(zhì)芯片; 抗體固定; 夾心反應; 酶聯(lián)免疫吸附分析; 氨基表面; 戊二醛; 多聚賴氨酸

蛋白質(zhì)芯片可用于研究蛋白質(zhì)分子之間的相互作用,在分子識別、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、質(zhì)量控制、高通量和快速檢測領(lǐng)域有著廣泛的應用前景[1-6].構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片的基礎(chǔ)是將特異性的蛋白質(zhì)分子(如抗體分子)固定到芯片表面并保持其生物學活性.由于蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上和化學性質(zhì)上都比DNA更復雜[7-8],在固定到固體表面的過程中容易失活,一般認為這可能是由于固相表面的化學微環(huán)境因素導致了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變[9-11].此外,化學的、物理學的以及結(jié)構(gòu)上的種種差異使得各種蛋白質(zhì)在固體表面上的固定效率呈現(xiàn)很大差異[12-13].因此對芯片表面蛋白質(zhì)固定策略的研究是極其重要的.如何在不同的固相表面固定足夠多的保持生物活性的蛋白質(zhì)分子是具有挑戰(zhàn)性的工作,也是眾多蛋白質(zhì)組學研究者孜孜追求的目標[14-20],許多研究者開發(fā)出各種新穎的蛋白質(zhì)固定技術(shù),并取得了較好的效果.

表面化學在蛋白質(zhì)固定中扮演了一個極其重要的角色,各種固定蛋白質(zhì)的策略都離不開對固相表面的化學修飾.首先需要在固相表面(如硅片、玻片、塑料等)衍生出化學活性的功能團,然后通過化學反應將蛋白質(zhì)分子(如抗體分子)偶聯(lián)固定到這種化學活化的固相表面.在這個過程中,如何提高偶聯(lián)的效率并保持蛋白質(zhì)分子的生物活性是主要挑戰(zhàn).目前已經(jīng)有許多不同的表面處理方法和共價偶聯(lián)方法[12,14-15,21].這些方法大致可以分為四類:(a)直接物理吸附[22-24],如在聚苯乙烯表面和聚賴氨酸表面直接吸附蛋白質(zhì)分子;(b)直接共價連接[15,25],如在短鏈氨基、巰基或羧基表面直接偶聯(lián)蛋白質(zhì)分子;(c)加入間隔臂共價連接[26-29],即在偶聯(lián)蛋白質(zhì)分子之前,先引入一層高分子,通常選擇樹枝狀高分子或具有較好生物相容性的高聚物;(d)利用生物親和作用固定蛋白質(zhì)分子[17,30-31],如先將結(jié)合蛋白A固定到固相表面,然后再利用它們與免疫球蛋白Fc段的特異性結(jié)合固定抗體分子.雖然已經(jīng)有很多文獻報道了上述不同的表面修飾方法,但是很少有文獻系統(tǒng)研究這些方法對蛋白質(zhì)固定化效果的影響.因此,我們設(shè)計了一個系統(tǒng)研究方案,研究了在硅基二氧化硅表面不同表面修飾方法對癌胚抗原(CEA)抗體固定的影響,以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)評價CEA抗體的固定效果,以期優(yōu)化篩選出最佳的抗體固定策略用于蛋白質(zhì)芯片的進一步開發(fā).

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES,99%),3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS,85%,比利時ACROS公司);3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTS, 97%,美國Alfa Aesar公司);對醛基苯甲酸(FBA, 97%),聚苯乙烯(PS,平均分子量25000),多聚賴氨酸(ε-PLL,分子量70-150 kDa),蛋白A(Protein A),蛋白G(Protein G),親和素(Avidin),生物素(D-Biotin,美國Sigma-Aldrich公司);戊二醛(GA,25%(φ)水溶液),2-嗎啉乙磺酸(MES,ultra grade),吐溫20(Tween 20,美國Merck公司);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,98%),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,98+%),SMCC(4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)/sulfo-SMCC(美國Pierce Biotechnology公司);癌胚抗原(CEA,美國Fitzgerald Industries International Inc.公司);抗癌胚抗原包被抗體(CEA Ab),生物素化抗癌胚抗原包被抗體(CEA Ab-Biotin),辣根酶標記抗癌胚抗原標記抗體(CEA Ab-HRP),TMB顯色液(北京博邁世紀生物技術(shù)有限公司);牛血清白蛋白(BSA,98%),小牛血清,羊抗人IgG純化抗體(≥95%),蔗糖(≥99%),海藻糖(≥99%,北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司);殼聚糖(chitosan,分子量150 kDa,脫乙酰度95%);磷酸鹽緩沖液(PBS,3.63 g Na2HPO4·12H2O和0.24 g KH2PO4溶于超純水并定容至1 L);碳酸鹽緩沖液(CB,1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3溶于超純水并定容至1 L);MES緩沖液(MES,15.92 g MES溶于900 mL超純水,再用NaOH調(diào)節(jié)pH值到6.5,最后用超純水定容至1 L);無水乙醇(分析純),甲苯(分析純),N,N-二甲基甲酰胺(DMF,分析純,北京化工廠);其他試劑為市售分析純或更高級別.

EASY pure LF超純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司);PDC-M型等離子清洗器(成都銘恒科技發(fā)展有限公司);ZD-85氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠);JC2000C1全自動接觸角儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司);RT-2100C酶標分析儀(深圳市雷杜電子有限公司);微反應池(7.5 mm× 13 mm×5 mm,自制);具有200 nm厚二氧化硅膜的硅片(6.6 mm×10.7 mm×0.75 mm,北京大學微電子學系).

1.2 硅片的前處理

先用無水乙醇和去離子水交替清洗硅片3次,并用氮氣流吹干,然后置于等離子清洗器中處理2 min(電壓600 V,氧氣流量800 mL·min-1),使硅片表面生成一層活性的羥基(接觸角＜5°).等離子處理后的硅片應立即進行后續(xù)的表面化學修飾,因為這些活性的羥基是不穩(wěn)定的,在空氣中容易再次交聯(lián)形成硅氧橋鍵[32-33].

1.3 硅片表面不同修飾方法固定抗體

1.3.1 直接吸附抗體

將氧等離子體處理好的硅片浸入到10 mg·mL-1PS的甲苯溶液和10 mg·mL-1PLL的PBS溶液中,置于室溫下浸泡過夜,然后分別取出.PS硅片直接甩干;PLL硅片用超純水潤洗5次,并用氮氣吹干.然后將兩種表面的硅片置于50℃烘箱中烘烤30 min,取出自然冷卻至室溫.將抗癌胚抗原(CEA)包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w,質(zhì)量分數(shù))海藻糖[15,34], CB溶液)分別滴加到兩種硅片表面,置于4℃放置過夜(如圖1(a)所示).

1.3.2 直接共價連接抗體

將氧等離子體處理好的硅片分別迅速浸入到5%(φ,體積分數(shù))APTES的乙醇溶液,5%(φ,體積分數(shù))GPTS的乙醇溶液,5%(φ)MPTS的乙醇溶液中并置于37℃氣浴恒溫振蕩器反應2 h.反應完成后用無水乙醇清洗5次,并用氮氣吹干.其中APTES硅片置于90℃烘箱中烘烤40 min.分別得到氨基硅片,環(huán)氧基硅片和巰基硅片.然后用四種方式偶聯(lián)固定抗體:(1)直接通過環(huán)氧基連接抗體,將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到環(huán)氧基硅片表面,然后置于4℃放置過夜;(2)通過SMCC連接抗體,將巰基硅片浸泡在1 mg·mL-1SMCC的DMF溶液或sulfo-SMCC的PBS溶液中37℃反應1 h,用無水乙醇或PBS清洗干凈后將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到硅片表面,然后置于4℃放置過夜;(3)通過戊二醛連接抗體,將氨基硅片浸泡在5%(φ)戊二醛的PBS溶液中室溫反應1.5 h,PBS清洗干凈后將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到硅片表面,然后置于4℃放置過夜;(4)通過EDC/NHS活化羧基連接抗體,將氨基硅片浸泡在50 mg·mL-1對醛基苯甲酸的DMF溶液中37℃反應1 h得到羧基化表面,DMF清洗干凈后再將羧基硅片浸泡在EDC和NHS的混合溶液中(0.4 mol· L-1EDC+0.1 mol·L-1NHS,pH 6.5,MES溶液)室溫反應30 min,4℃冷藏MES溶液清洗干凈后再將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖,PBS溶液)滴加到硅片表面,然后置于4℃放置過夜(如圖1 (b)示).

1.3.3 加入間隔臂共價連接抗體

按照1.3.2節(jié)的方法用APTES將硅片表面先修飾成氨基,然后將氨基硅片浸泡在5%(φ)戊二醛的PBS溶液中2 h,PBS清洗干凈后將硅片浸入到1 mg·mL-1PLL的PBS溶液(pH 7.4)或1 mg·mL-1殼聚糖的醋酸溶液(pH 6.5)中室溫反應6 h,PBS清洗干凈后再用戊二醛將表面醛基化,然后將CEA包被抗體(10 μg·mL-1,0.5%(w)海藻糖PBS溶液)滴加到硅片表面,置于4℃放置過夜(如圖1(c)示).

1.3.4 利用生物親和作用固定抗體

按照1.3.3節(jié)的方法通過聚賴氨酸和戊二醛將親和蛋白A/G或親和素Avidin固定到硅片表面, PBS清洗后再將CEA包被抗體或CEA包被抗體-Biotin滴加到相應的表面,然后置于4℃放置過夜(如圖1(d)示).

1.4 抗體芯片的封閉

將各種CEA包被抗體芯片分別浸入到含有10 mg·mL-1BSA的PBS溶液中,置于氣浴恒溫振蕩器上37℃溫育1 h,然后分別用0.1%(φ)PBST清洗3次,并浸泡在保護劑(5%(w)蔗糖PBS溶液)中置于4℃待測.其中,通過蛋白A/G親和固定的抗體硅片(蛋白A/G-CEA抗體硅片)需先用羊抗人IgG抗體進行封閉,然后再用BSA封閉;通過親和素-生物素親和固定的抗體硅片(Avidin-Biotin-CEA抗體硅片)需先用D-Biotin進行封閉,然后再用BSA封閉.

1.5 抗體芯片固定效果的酶聯(lián)評價

為了評價硅片表面固定的抗體的密度和生物學活性,基于抗體的免疫學特性,我們采用抗原抗體分析中常用的酶聯(lián)免疫夾心反應的方法進行評價(圖2).

這一評價方法可以定量地反映硅片上的抗體固定效果,即硅片表面具有生物活性的抗體分布情況.并且可以移植到其他標志物(如熒光標記或磁標記)的分析檢測中.具體的操作步驟如下.

1.5.1 抗原抗體的免疫夾心反應

將不同固定方法修飾的抗體芯片(各5片以上)清洗干凈后,置于微反應池中,然后加入不同濃度的CEA抗原(200 μL,45%(φ)小牛血清稀釋),置于氣浴恒溫振蕩器上37℃溫育1 h,反應完成后分別取出用0.1%(φ)PBST清洗3遍.再將硅片放入新的微反應池中,接著再加入CEA標記抗體-HRP(4 μg· mL-1,200 μL,15 mg·mL-1BSA稀釋),置于37℃溫育1 h,最后分別取出用0.1%(φ)PBST清洗3遍.

1.5.2 顯色反應

將免疫反應后的芯片置于新的微反應池中,加入TMB顯色液各150 μL,37℃溫育15 min后,將顯色反應后的溶液移取到96孔酶聯(lián)板中,再分別加入終止液(2 mol·L-1H2SO4)各50 μL,最后用酶標儀進行比色測試,比色測試應在加入終止液后5 min內(nèi)完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 直接吸附抗體

蛋白質(zhì)之間的吸附作用主要來自于疏水作用、靜電作用、范德華力作用、路易斯酸堿力作用以及構(gòu)象變化和表面附近受限的側(cè)向擴散[13].通過物理吸附的方式直接固定抗體是最經(jīng)典的抗體固定方式,常用的方法是將抗體吸附到疏水性表面(如聚苯乙烯(PS)表面)或帶有高密度電荷的表面(如多聚賴氨酸(PLL)包被的玻片),這種方法具有價格低廉、操作簡便的優(yōu)點.圖3是對兩種最常用的物理吸附固定抗體方法的測試結(jié)果,從圖中可以看出,在PS表面隨著CEA抗原濃度的增加呈現(xiàn)出較好的線性相關(guān),這說明在PS表面通過疏水相互作用可以固定上大量具有生物活性的CEA抗體,但是卻具有較高的非特異性吸附.而在PLL表面則幾乎沒有免疫響應,這說明通過靜電相互作用并未能有效固定CEA抗體.我們認為這可能是因為二氧化硅表面主要為一層電中性的硅羥基或硅氧橋鍵,很難吸附上電荷富集的PLL,因而沒有能夠形成一層富集電荷的表面來用于進一步吸附CEA抗體.由于吸附是競爭的和可逆的,因此在后續(xù)的免疫反應和多次沖洗過程中,可能造成硅片表面抗體的脫落,進而影響其結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性,并且通過物理吸附固定的抗體通常呈現(xiàn)區(qū)域聚集狀,也具有較高的非特異性吸附,這在高靈敏度的分析檢測中是個很嚴重的問題,因而其應用范圍有限.

2.2 直接共價連接抗體

相對于物理吸附法固定抗體,通過氨基、羧基或巰基共價連接的方式可以使得抗體的固定更加穩(wěn)定.通常的方法是先用硅烷試劑(如APTES、MPTS或GPTS等)在硅片表面衍生出具有化學活性的功能團(如氨基、巰基、羧基、環(huán)氧基等),然后再通過各種偶聯(lián)試劑(如戊二醛、SMCC、EDC/NHS等)將抗體固定到硅片表面.由于固定效率依賴于交聯(lián)基團的數(shù)量和偶聯(lián)反應的效率,抗體種類的變化和反應條件的波動常常會帶來較大影響,因而通過直接共價連接的方式固定抗體的密度常常較低.圖4是常用的幾種直接共價連接的方式固定抗體的酶聯(lián)測試結(jié)果.從圖中可以看出,利用APTES進行硅烷化,戊二醛作為偶聯(lián)試劑具有最好的固定效果,但是仍然具有較高的非特異性吸附.這可能是因為APTES化的硅片表面形成的是一種致密的毛刷結(jié)構(gòu),因而具有一定的疏水性,可能帶來較高的非特異性吸附.利用SMCC偶聯(lián)巰基和氨基比通過EDC/NHS活化羧基連接氨基的偶聯(lián)效果要弱些,這可能是因為EDC/NHS和SMCC較為活潑,在偶聯(lián)過程中容易失活或逆平衡解離所致.而環(huán)氧表面對氨基的直接偶聯(lián)效果不太好可能是因為環(huán)氧基團與氨基的反應在中性條件下較慢所致[35],值得指出的是,環(huán)氧基團偶聯(lián)氨基開環(huán)之后會生成一個電中性的親水羥基,有助于減弱非特異性吸附.

2.3 加入不同的間隔臂共價連接抗體

為了提高共價連接固定抗體的效率,考慮在固定抗體之前先在硅片表面引入一層大分子間隔臂,有文獻報道大分子間隔臂的引入可以有效地改善固相表面的親水性和生物兼容性,改善抗原抗體免疫結(jié)合時的空間位阻[36-37],提高硅片表面抗體的免疫反應效率.我們比較了常用的蛋白質(zhì)分子(BSA和IgG)和多氨基聚合物(PLL和殼聚糖),偶聯(lián)試劑為戊二醛或SMCC,實驗結(jié)果如圖5所示.

從圖5中可以很明顯地看出,多氨基聚合物的效果遠遠優(yōu)于蛋白質(zhì)分子.這可能是因為多氨基聚合物中含有更多的可以參與反應的活性氨基,因而具有更高的偶聯(lián)反應效率.多聚賴氨酸(PLL)和殼聚糖(chitosan)均具有很好的固定效果,其中多聚賴氨酸表面具有更低的非特異性吸附,這可能是因為多聚賴氨酸分子內(nèi)含有許多親水功能團,可以極大地增強芯片表面的親水性,從而起到了降低非特異性吸附的作用.

2.4 利用生物親和作用固定抗體

由于參加反應的氨基、羧基或巰基基團與偶聯(lián)試劑的共價反應是難以控制的,如果交聯(lián)發(fā)生在蛋白質(zhì)的活性位點上可能會顯著降低蛋白質(zhì)的生物活性.為了進一步提高硅片表面固定抗體的生物活性,并且為了適應各種不同抗體的固定,我們考慮利用生物親和作用的方式固定抗體.最常用的生物親和作用有蛋白A/G-IgG抗體(Fc段)親和作用和Avidin-Biotin親和作用[17,31,38].在本實驗中,我們分別將蛋白A、蛋白G、Avidin分子共價固定到硅片表面,再利用生物親和作用將CEA抗體(IgG抗體)或CEA抗體-Biotin固定到硅片表面,然后分別進行酶聯(lián)免疫測試評價抗體固定效果,實驗結(jié)果如圖6所示.

從圖6中可以看出,通過生物親和作用可以有效地固定抗體,并且具有較高的生物活性,這可能是因為蛋白A、蛋白G或Avidin分子承受了固相表面的微環(huán)境變化和共價交聯(lián)的化學變化而非抗體本身,并且借助生物親和作用可以實現(xiàn)抗體的定向固定,因而最大程度地保留了抗體特異結(jié)合位點的生物活性和空間取向[10,17,39-41].同時我們發(fā)現(xiàn),這種利用生物親和作用固定抗體的方法具有較高的非特異性吸附.這可能是因為這些生物親和表面不能有效地封閉造成的.特別是Avidin表面,由于固定的是生物素化的包被抗體,而生物素是電子富集的小分子,在抗體上的標記通常是隨機并且大量的(一個抗體分子上通常連接有幾個到十幾個Biotin小分子),因而對后續(xù)的CEA標記抗體-HRP分子具有較強的靜電吸附作用,解決這個問題的方法之一是對包被抗體進行位點特異性生物素化[42].而共價連接兩層聚賴氨酸(PLL)的表面可以進一步提高固定效率和降低非特異性吸附.

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明,通過共價連接固定抗體可以得到比通過物理吸附更好的固定效果,各種偶聯(lián)反應中戊二醛對氨基的偶聯(lián)效率最高.引入含有多功能團的聚合物分子可以提高偶聯(lián)固定的反應效率,多聚賴氨酸和殼聚糖是很好的氨基放大試劑,可以用于氨基偶聯(lián)試劑(如戊二醛)的增強固定,減弱非特異性吸附,并且可以增加抗體分子與平面硅片之間的距離,增加固定抗體的柔韌度,改善空間取向,從而提高硅片表面固定抗體的生物活性.對于IgG類型的某些抗體,可以利用蛋白A或蛋白G的親和作用進行定向固定,最大限度地保持固定抗體的生物活性.

1 Zhu,H.;Snyder,M.Curr.Opin.Chem.Biol.,2001,5:40

2 MacBeath,G.Nat Genet,2002,32(suppl.):526

3 Templin,M.F.;Stoll,D.;Schrenk,M.;Traub,P.C.;V?hringer,C. F.;Joos,T.O.Trends Biotechnol.,2002,20:160

4 Ng,J.H.;Ilag,L.L.Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2002,6:329

5 Wilson,D.S.;Nock,S.Angew.Chem.Int.Edit.,2003,42:494

6 Angenendt,P.Drug Discovery Today,2005,10:503

7 Kusnezow,W.;Hoheisel,J.D.Biotechniques,2002,33(suppl.):14

8 Liotta,L.A.;Espina,V.;Mehta,A.I.;Calvert,V.;Rosenblatt,K.; Geho,D.;Munson,P.J.;Young,L.;Wulfkuhle,J.;Petricoin III,E. F.Cancer Cell,2003,3:317

9 Lutanie,E.;Voegel,J.C.;Schaaf,P.;Freund,M.;Cazenave,J.P.; Schmitt,A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89:9890

10 Vijayendran,R.A.;Leckband,D.E.Anal.Chem.,2000,73:471

11 Rossier,J.S.;Gokulrangan,G.;Girault,H.H.;Svojanovsky,S.; Wilson,G.S.Langmuir,2000,16:8489

12 Angenendt,P.;Gl?kler,J.;Murphy,D.;Lehrach,H.;Cahill,D.J. Anal.Biochem.,2002,309:253

13 Kusnezow,W.;Hoheisel,J.D.J.Mol.Recognit.,2003,16:165

14 Seong,S.Y.Clin Diagn Lab Immunol,2002,9:927

15 Kusnezow,W.;Jacob,A.;Walijew,A.;Diehl,F.;Hoheisel,J.D. Proteomics,2003,3:254

16 Niemeyer,C.M.;Wacker,R.;Adler,M.Nucl.Acids Res.,2003, 31:e90

17 Peluso,P.;Wilson,D.S.;Do,D.;Tran,H.;Venkatasubbaiah,M.; Quincy,D.;Heidecker,B.;Poindexter,K.;Tolani,N.;Phelan,M.; Witte,K.;Jung,L.S.;Wagner,P.;Nock,S.Anal.Biochem.,2003, 312:113

18 Ramachandran,N.;Hainsworth,E.;Bhullar,B.;Eisenstein,S.; Rosen,B.;Lau,A.Y.;Walter,J.C.;LaBaer,J.Science,2004,305: 86

19 Oh,S.J.;Hong,B.J.;Choi,K.Y.;Park,J.W.OMICS,2006,10: 327

20 Iwata,R.;Satoh,R.;Iwasaki,Y.;Akiyoshi,K.Colloids Surf.B, 2008,62:288

21 Hermanson,G.T.Bioconjugate techniques.2nd ed.Rockford, Illinois:Academic Press,2008

22 Haab,B.B.;Dunham,M.J.;Brown,P.O.Genome Biol.,2001,2: 0004.1

23 Stillman,B.A.;Tonkinson,J.L.Biotechniques,2000,29:630

24 Qian,W.;Yao,D.;Yu,F.;Xu,B.;Zhou,R.;Bao,X.;Lu,Z.Clin. Chem.,2000,46:1456

25 MacBeath,G.;Schreiber,S.L.Science,2000,289:1760

26 Piehler,J.;Brecht,A.;Geckeler,K.E.;Gauglitz,G.Biosens. Bioelectron.,1996,11:579

27 Penzol,G.;Armisén,P.;Fernández-Lafuente,R.;Rodés,L.; Guisán,J.M.Biotechnol.Bioeng.,1998,60:518

28 Afanassiev,V.;Hanemann,V.;Wolfl,S.Nucl.Acids Res.,2000, 28:e66

29 Piletsky,S.A.;Matuschewski,H.;Schedler,U.;Wilpert,A.; Piletska,E.V.;Thiele,T.A.;Ulbricht,M.Macromolecules,2000, 33:3092

30 Wilson,D.S.;Nock,S.Curr.Opin.Chem.Biol.,2002,6:81

31 Neubert,H.;Jacoby,E.S.;Bansal,S.S.;Iles,R.K.;Cowan,D.A.; Kicman,A.T.Anal.Chem.,2002,74:3677

32 Gupta,B.;Plummer,C.;Bisson,I.;Frey,P.;Hilborn,J. Biomaterials,2002,23:863

33 Stine,R.;Cole,C.L.;Ainslie,K.M.;Mulvaney,S.P.;Whitman,L. J.Langmuir,2007,23:4400

34 Gibson,T.D.;Woodward,J.R.Protein stabilization in biosensor systems//Biosensors and chemical sensors.Washington,DC: American Chemical Society,1992:40

35 Mateo,C.;Torres,R.;Fernández-Lorente,G.;Ortiz,C.;Fuentes, M.;Hidalgo,A.;López-Gallego,F.;Abian,O.;Palomo,J.M.; Betancor,L.;Pessela,B.C.C.;Guisan,J.M.;Fernández-Lafuente, R.Biomacromolecules,2003,4:772

36 Lee,S.D.;Hsiue,G.H.;Chang,P.C.T.;Kao,C.Y.Biomaterials, 1996,17:1599

37 Kato,K.;Ikada,Y.Biotechnol.Bioeng.,1995,47:557

38 Lee,W.;Oh,B.K.;Bae,Y.M.;Paek,S.H.;Lee,W.H.;Choi,J. W.Biosensors and Bioelectronics,2003,19:185

39 Turková,J.J.Chromatogr.B,1999,722:11

40 Jung,Y.;Lee,J.M.;Jung,H.;Chung,B.H.Anal.Chem.,2007, 79:6534

41 V?limaa,L.Streptavidin——a versatile binding protein for solidphase immunoassays[D].Turku:University of Turku,2008

42 Lue,R.Y.P.;Chen,G.Y.J.;Zhu,Q.;Lesaicherre,M.-L.;Yao,S. Q.Site-specific immobilization of biotinylated proteins for protein microarray analysis//Protein arrays.Totowa:Humana Press Inc., 2004:85

Effect of Surface Chemical Properties of a Silicon Chip on Antibody Immobilization

ZHOU Wen-Wen1,2LIAN Jie1,2HU Ke-Jia1,2GAO Yun-Hua1,*XU Bai1,*
(1Key Laboratory of Photochemical Conversion and Optoelectronic Materials,Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049,P.R.China)

The key to constructing a protein microarray is the stable immobilization of proteins and the retention of their biological activities.In this study,immobilization of the carcinoembryonic antigen(CEA)antibody onto a silicon dioxide surface was investigated by physical adsorption,direct chemical covalent conjugation,spacer-added chemical covalent conjugation,and biological affinity interactions.Based on the specific antibody-antigen interactions,the sandwich reaction,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was chosen to evaluate various immobilization strategies.The most efficient immobilization strategy was with glutaraldehyde as a coupling reagent between the CEA antibody and the amino surface.The attachment of a spacer-arm comprising poly-L-lysine significantly improved the immobilization efficiency and simultaneously decreased nonspecific adsorption.High immobilization efficiency and stronger nonspecific adsorption were also observed when the CEA antibody was immobilized by bioaffinity interactions.

Protein microarray;Antibody immobilization;Sandwich reaction;Enzyme-linked immunosorbent assay;Amino surface;Glutaraldehyde;Poly-L-lysine

O647

Received:April 22,2010;Revised:July 9,2010;Published on Web:September 3,2010.

*Corresponding authors.GAO Yun-Hua,Email:yhgao@mail.ipc.ac.cn;Tel:+86-10-82543581.XU Bai,Email:nanobioic@gmail.com.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20975106),Funds of the Chinese Academy of Sciences for Key

Topics in Innovation Engineering(KJCX2-YW-M15)and Important National Science&Technology Specific Projects,China(2008ZX08012-001).

國家自然科學基金(20975106),中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KJCX2-YW-M15)及國家重大專項(2008ZX08012-001)資助

?Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica