丁盼盼,高淑紅,陳長華,葉蕊芳,武 培,馬朝安

（1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237;2.河南天方藥業(yè)股份有限公司,河南駐馬店 463000）

二甲基亞砜對(duì)紅霉素合成的影響研究

丁盼盼1,高淑紅1,陳長華1,葉蕊芳1,武 培2,馬朝安2

（1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237;2.河南天方藥業(yè)股份有限公司,河南駐馬店 463000）

分別研究了搖瓶和發(fā)酵罐中二甲基亞砜對(duì)紅霉素合成的影響。通過搖瓶實(shí)驗(yàn)確定了適宜的二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)和添加時(shí)間,并在15 L發(fā)酵罐中考察了二甲基亞砜對(duì)紅霉素合成代謝的影響。結(jié)果表明,在紅色糖多孢菌發(fā)酵48 h時(shí),向發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中流加體積分?jǐn)?shù)為0.16%的二甲基亞砜,紅霉素效價(jià)可達(dá)7961 U·mL-1,比對(duì)照提高11.6%;二甲基亞砜可以提高羥基化酶——P450單加氧酶的含量,從而提高紅霉素產(chǎn)量。

紅霉素;二甲基亞砜;生物合成;P450單加氧酶

紅霉素（Erythromycin,Er）是一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,包括紅霉素A（ErA）、紅霉素B（ErB）、紅霉素C（ErC）、紅霉素D（ErD）、紅霉素 E（ErE）和紅霉素 F（ErF）。在臨床上廣泛應(yīng)用的是紅霉素A,它的抑菌活性最高,最初是從一種放線菌——紅色糖多孢菌（S2accharopolyspora ery thraea）中分離出來的[1]。中國藥典（95版）規(guī)定紅霉素成品的生物效價(jià)按無水物計(jì)算,每1 mg效價(jià)不得少于920個(gè)紅霉素單位。紅霉素A的生物合成途徑如圖1所示[2]。

圖1 紅霉素A的生物合成Fig.1 Biosyn thesis of erythromycin A

從圖1可以看出,欲得到高產(chǎn)率及高含量的紅霉素A,紅霉素D是一個(gè)很關(guān)鍵的中間產(chǎn)物。紅霉素D沿兩條分支途徑轉(zhuǎn)化為紅霉素A,途徑 I：紅霉素D在羥基化酶 Ery K的作用下羥基化,生成紅霉素C,然后在甲基化酶 EryG的作用下甲基化,生成紅霉素A;途徑Ⅱ：紅霉素D在 EryG的作用下甲基化,生成紅霉素B,然后在Ery K的作用下羥基化,生成紅霉素A。

據(jù)報(bào)道[3],對(duì)于羥基化反應(yīng),小分子有機(jī)溶劑[如二甲基亞砜（DM SO）、乙醇、丙酮等]可使細(xì)胞色素P450單加氧酶m RNA量增加,最終使細(xì)胞色素P450單加氧酶（Ery K）表達(dá)量增加。

作者在此考察了DM SO體積分?jǐn)?shù)和添加時(shí)間對(duì)紅霉素合成的影響,并研究了DM SO對(duì)P450單加氧酶含量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與原料

紅色糖多孢菌 HD,華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

淀粉、黃豆餅粉、糊精,河南天方藥業(yè)股份有限公司;其余原料均為市售工業(yè)純。

1.2 培養(yǎng)基

搖瓶種子及罐一級(jí)種子培養(yǎng)基（%）：可溶性淀粉2.0,糊精 2.5,黃豆餅粉 2.5,玉米漿 0.8,硫酸銨0.18,氯化鈉0.4,碳酸鈣 0.2,豆油 3滴 ·瓶-1,消前p H值7.4。裝量30 mL·（250 mL）-1。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：淀粉5.0,黃豆餅粉3.0,玉米漿 0.4,硫酸銨 0.15,碳酸鈣0.4,豆油3滴·瓶-1,葡萄糖25,p H值7.0～7.2。

罐二級(jí)種子培養(yǎng)基（%）：淀粉2.0,黃豆餅粉2.5,糊精2.5,玉米漿2.3,硫酸銨0.15,碳酸鈣0.2,豆油0.2,消前p H值7.4。

罐發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：淀粉2.0,黃豆餅粉2.5,糊精2.5,玉米漿2.3,氯化鈉0.15,碳酸鈣0.2,豆油0.2,消前p H值7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將種子液于34℃、220～240 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將接入種子液的發(fā)酵液于34℃、220～240 r·min-1搖床培養(yǎng) 168 h。

罐發(fā)酵培養(yǎng)：先將甘油管保藏的菌種按10%接種量接入裝有60 m L一級(jí)種子培養(yǎng)基的500 m L一級(jí)種子瓶中,（34±1）℃培養(yǎng)48 h后;再按10%接種量接入裝量相同的500 m L二級(jí)種子瓶中,同溫培養(yǎng)48 h;最后按10%接種量接入裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中,培養(yǎng)7 d。

1.4 分析與檢測(cè)

（1）P450單加氧酶含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[4～6]測(cè)定P450單加氧酶含量。

（2）總蛋白含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量。

（3）糖和氨基氮的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[7],分別采用費(fèi)林試劑法和甲醛法測(cè)定糖和氨基氮含量。

（4）生物效價(jià)的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[8],采用管碟法測(cè)定紅霉素生物效價(jià)。

（5）化學(xué)效價(jià)的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[9],采用磷酸水解法測(cè)定紅霉素化學(xué)效價(jià)。

（6）紅霉素含量的測(cè)定：采用 HPLC法測(cè)定紅霉素含量。

高效液相色譜儀：717 Plus autosamp ler,2487 Dual absorbance detector,1525 Binary HPLC pump,Waters公司。

色譜柱為反相C18柱RP2C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流動(dòng)相為乙腈（色譜純）∶0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（分析純）緩沖溶液（32∶68）,流速為1 mL·min-1,檢測(cè)波長為205 nm,柱溫為35℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 DMSO添加時(shí)間對(duì)紅霉素效價(jià)的影響

分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時(shí)添加0.12%（體積分?jǐn)?shù),下同）的DM SO,考察其對(duì)紅霉素效價(jià)的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 DMSO添加時(shí)間對(duì)紅霉素效價(jià)的影響Fig.2 Effect of DMSO adding time on chem ical titre of erythromycin

由圖 2 可以看出 ,在發(fā)酵 0 h、48 h、72 h、120 h 添加0.12%的DMSO均可提高紅霉素效價(jià),且在發(fā)酵48 h添加DM SO時(shí),紅霉素效價(jià)達(dá)到最大。因此,確定DMSO最適添加時(shí)間為48 h。

2.2 DMSO體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅霉素效價(jià)的影響

搖瓶發(fā)酵48 h,分別添加0.08%、0.16%、0.24%、0.32%、0.40%、0.48%、0.56%的 DMSO,考察 DMSO體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅霉素效價(jià)的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 DMSO體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅霉素效價(jià)的影響Fig.3 Effect of DMSO volume fraction on chem ical titre of erythromycin

由圖3可以看出,DM SO體積分?jǐn)?shù)小于0.32%時(shí),紅霉素效價(jià)較對(duì)照有所提高,最高增加13%;DM 2 SO體積分?jǐn)?shù)為0.40%～0.48%時(shí),紅霉素效價(jià)與對(duì)照相比,增幅不大;DM SO體積分?jǐn)?shù)為0.56%時(shí),紅霉素效價(jià)降低。這可能是因?yàn)镈M SO體積分?jǐn)?shù)過高抑制了菌體生長,導(dǎo)致紅霉素合成下降。因此,確定DM SO的最適體積分?jǐn)?shù)為0.16%。

2.3 DMSO對(duì)紅霉素合成代謝的影響

在15 L FUS-15L（A）發(fā)酵罐中,于紅色糖多孢菌發(fā)酵48 h時(shí)流加0.16%的DM SO,每隔一段時(shí)間取樣分析,考察DM SO對(duì)紅霉素合成代謝的影響。

2.3.1 DM SO對(duì)菌體糖耗速率的影響（圖4）

圖4 DMSO對(duì)糖耗速率的影響Fig.4 Effect of DMSO on consum ption rate of sugar

從圖4可以看出,DM SO罐的平均糖耗速率（1.0 g·L-1·h-1）比對(duì)照罐（0.6 g·L-1·h-1）高。在發(fā)酵115 h左右,DM SO罐的糖耗速率出現(xiàn)最低值,只有0.29 g·L-1·h-1。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵115 h左右,發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)大部分被消耗,導(dǎo)致部分菌體自溶,因而糖耗也相應(yīng)降低。

2.3.2 DMSO對(duì)菌濃的影響（圖5）

圖5 DMSO對(duì)菌濃的影響Fig.5 Effect of DMSO on cell growth

從圖5可以看出,對(duì)照罐的菌濃在發(fā)酵68 h達(dá)到48%,DM SO罐的菌濃比對(duì)照稍低,為37%。隨著發(fā)酵不斷進(jìn)行,由于補(bǔ)料、取樣等因素使得發(fā)酵后期對(duì)照罐的菌濃維持在60%左右,DM SO罐在55%左右。可見,流加0.16%的DM SO不會(huì)對(duì)紅色糖多孢菌產(chǎn)生大的毒性。

2.3.3 DMSO對(duì)紅霉素效價(jià)的影響（圖6）

圖6 DMSO對(duì)紅霉素效價(jià)的影響Fig.6 Effect of DMSO on chem ical titre of erythromycin

從圖6可以看出,對(duì)照罐和DM SO罐在發(fā)酵67 h的效價(jià)均為3000 U·m L-1左右;對(duì)照罐在發(fā)酵72 h后,效價(jià)增長緩慢,最終效價(jià)為7132 U·m L-1;DM 2 SO罐雖然在發(fā)酵72～100 h時(shí),效價(jià)增長比對(duì)照罐緩慢,但在發(fā)酵100 h后增長明顯,最終效價(jià)達(dá)到7961 U·mL-1,比對(duì)照罐提高了11.6%。

2.3.4 DMSO對(duì)P450單加氧酶含量的影響（圖7）

圖7 DMSO對(duì)P450單加氧酶含量的影響Fig.7 Effect of DMSO on conten t of P450

從圖7可以看出,在發(fā)酵96 h時(shí),對(duì)照罐的 P450單加氧酶含量達(dá)到最高值,此時(shí)是紅霉素合成的最佳時(shí)期;在整個(gè)發(fā)酵過程中,DM SO罐的P450單加氧酶含量基本上高于對(duì)照罐;發(fā)酵結(jié)束,DM SO罐的P450單加氧酶含量達(dá)0.825 nmol·mg-1,比對(duì)照罐（0.430 nmol·mg-1）提高了0.395 nmol·m g-1。由此推斷,DM SO是通過提高羥基化酶——P450單加氧酶的含量來提高紅霉素的產(chǎn)量的。

2.4 討論

DM SO是具有一定毒性的物質(zhì),添加量過多,會(huì)導(dǎo)致紅霉素效價(jià)顯著下降,因此在合適的時(shí)間添加適量的DM SO才會(huì)在基本不影響菌體正常代謝的前提下提高紅霉素效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)未深入研究DM SO對(duì)菌體的負(fù)面影響,但因其毒性和化學(xué)性質(zhì),不可忽略可能帶來的潛在不良后果。

3 結(jié)論

分別研究了搖瓶發(fā)酵和15 L發(fā)酵罐中二甲基亞砜對(duì)紅霉素合成的影響。在紅色糖多孢菌發(fā)酵48 h時(shí),向發(fā)酵罐培養(yǎng)基中流加體積分?jǐn)?shù)為0.16%的二甲基亞砜,紅霉素效價(jià)可達(dá)7961 U·m L-1,比對(duì)照提高11.6%。研究DM SO作用機(jī)理發(fā)現(xiàn),DM SO是通過提高羥基化酶——P450單加氧酶的含量來提高紅霉素的產(chǎn)量的。

[1] 張部昌,趙志虎,馬清鈞.紅霉素基因工程研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2002,22（3）：40244.

[2] Carreras Christopher,Frykman Scott,Ou Sally,et al.Sacchar2opolyspora erythraea2catalyzed bioconversion of 62deoxyerythro2 nolide B analogs for p roduction of novel erythromycins[J].Journal of Biotechnology,2002,92（3）：2172228.

[3] 李安華,王藝軍,王明道,等.綠僵菌羥基化 16α,17α2環(huán)氧黃體酮的工藝研究[J].河南科學(xué),2007,25（5）：7542757.

[4] 吳寧,李紅梅,吳青青,等.漏蘆對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性及mRNA表達(dá)影響[J].中國公共衛(wèi)生,2007,23（7）：8272829.

[5] Tsuneo Omura,Ryo Sato.The carbon monoxide2binding pigment of liver microsomes.I.Evidence for its hemop rotein nature[J].Journal of Biological Chemistry,1964,239（7）：237022378.

[6] 李梅,曾凡榮.鏈霉菌細(xì)胞色素 P450研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35（7）：110721112.

[7] 劉剛,徐蓉.磷酸鎂對(duì)螺旋霉素發(fā)酵的影響[J].中國抗生素雜志,1997,22（3）：2312233.

[8] Li X B,Zhao G R,Zheng H,et al.Imp roved industrial fermenta2 tion of lincomycin by phospho rus feeding[J].Process Biochem,2007,42（4）：6622668.

[9] 范代娣,陳斌,尚龍安,等.紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[J].生物工程學(xué)報(bào),1999,15（1）：1042108.

Study on Effects of DMSO on Synthesis of Erythromycin

D ING Pan2pan1,GAO Shu2hong1,CHEN Chang2hua1,YE Rui2fang1,W U Pei2,M A Chao2an2
（1.State Key L aboratory of B ioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,
Shanghai200237,China;2.Henan Topfond Pharm aceutical Co.,L td.,Zhum ad ian463000,China）

The biosynthesisof erythrom ycin by addition of dimethyl sulfoxide（DM SO）into medium in shake flask or in 15 L bioreactor were studied.The suitable volume fraction and adding time of DM SO were deter2 mined through shake flask experiment,and the effects of DM SO on the synthetic metabolism of erythromycin w ere exp lo red in 15 L bio reacto r.The result showed that,in the 15 L bio reacto r,the chemical titre of erythro2 mycin achieved 7961 U·mL-1w hich was increased by 11.6%of the control w hen 0.16%（volume fraction）DM SO w as added into the medium at 48 h of fermentation ofSaccharopolyspora ery thraea.A dding DM SO could increase the content of P450,so that the yield of erythromycin was increased.

erythromycin;dimethyl sulfoxide（DMSO）;biosynthesis;P450

TQ 465.5 Q 93

A

1672-5425（2010）06-0069-04

2010-01-08

丁盼盼（1985-）,女,山東濟(jì)寧人,碩士研究生,研究方向：微生物發(fā)酵;通訊作者：高淑紅,講師。