丁安子,方桂杰,高 琴,謝衛(wèi)紅

（湖北工業(yè)大學生物工程學院發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢 430068）

含酯血紅蛋白分子印跡膜的制備

丁安子,方桂杰,高 琴,謝衛(wèi)紅

（湖北工業(yè)大學生物工程學院發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢 430068）

以丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯為功能單體、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑、牛血紅蛋白為模板分子,采用溶液聚合法,合成了具有選擇識別性的牛血紅蛋白分子印跡膜。結(jié)果表明,引入疏水性功能單體甲基丙烯酸甲酯,通過氫鍵和疏水作用的協(xié)同作用,蛋白質(zhì)印跡膜的專一選擇性得到顯著提高。

蛋白質(zhì)分子印跡膜;牛血紅蛋白;協(xié)同作用

分子印跡技術（Molecular imp rinted technology,M IT）指人工合成具有專一性識別作用受體的新技術。由于其良好的耐熱與耐化學性能以及高的專一選擇性,在色譜柱固定相及固相提取[1～3]、生物傳感器敏感元件[4]、模擬酶催化[5～7]等領域應用廣泛。

蛋白質(zhì)分子印跡技術是以蛋白質(zhì)為模板的一種大分子印跡技術,一般采用水溶性功能單體并在水相中以氫鍵與模板蛋白形成復合物,但在水相中形成氫鍵容易受水分子的干擾,影響了印跡孔穴的形成和印跡聚合物的選擇識別能力。研究表明,利用不同功能單體的協(xié)同作用可顯著提高蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的專一選擇性。宓懷風等合成了具有輔助識別聚合物鏈的新型單體,該單體可與功能單體丙烯酰胺組成多重有效的識別位點,有效提高印跡聚合物的專一選擇性[8,9]。Shea等以蜜蜂蜂毒毒素為模板、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,使用丙烯酰胺（AAm）、丙烯酸（AAc）、N2叔丁基丙烯酰胺（TBAm）等多種功能單體,利用多種作用力（氫鍵、正電荷靜電作用力、負電荷靜電作用力、疏水作用力）協(xié)同作用的方法,提高印跡納米微球的選擇性[10]。

作者在此采用溶液聚合法,以牛血紅蛋白為模板蛋白,在使用水溶性功能單體丙烯酰胺的基礎上,引入疏水性功能單體甲基丙烯酸甲酯,以N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,采用氧化還原引發(fā)體系引發(fā)聚合反應,在玻片上制備了具有選擇性識別能力的含酯牛血紅蛋白分子印跡膜。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

牛血紅蛋白（BHb）、肌紅蛋白（Mb）、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）,Sigma公司;牛血清蛋白（BSA）,B.M公司;溶菌酶（Lyz）,Am2 ersco公司;丙烯酰胺,Canalab公司;甲基丙烯酸甲酯（MMA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二甲基亞砜（DM 2 SO）、戊二醛,國藥集團化學試劑有限公司;32氨丙基三乙氧基硅烷（WD250）,武漢大學新有機硅有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為去離子水。

UV2Lambda 35型紫外可見分光光度計,美國Perkin Elmer公司。

1.2 蛋白質(zhì)分子印跡膜的制備

含酯印跡膜的制備：取丙烯酰胺84 mg、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺9 mg以及甲基丙烯酸甲酯42μL溶于1 mL除氧后的DM SO;以除氧后的p H值為6.40的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配制2×10-4mol·L-1BHb溶液。等體積混合上述單體溶液和模板蛋白溶液,并在氬氣保護下,加入0.1 mg·mL-1過硫酸銨40μL和 TEM ED 6μL。取混合溶液滴于玻片上,使其聚合成膜。生成的印跡膜（M IP）用1%SDS210%HAc洗脫液于脫色搖床上洗脫至紫外檢測不到模板分子為止,然后用去離子水洗凈殘留 SDS。以1 mL PBS代替模板蛋白溶液,同法制備非印跡膜（N IP）。

無酯印跡膜的制備：取丙烯酰胺111 mg、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺9 mg溶于1 m L除氧后的PBS,其余步驟同上。引發(fā)劑用量為0.1 mg·mL-1過硫酸銨20μL、TEM ED 3μL。

1.3 重結(jié)合性能的檢測

為了檢測M IP膜的重結(jié)合能力,向放置M IP膜的燒杯中加入1μmol·L-1BHb溶液3 m L,4℃下靜置;每隔一段時間取200μL溶液用紫外分光光度計于405 nm處測其吸光值,計算蛋白濃度,按下式計算重結(jié)合蛋白量（B）。

式中：c0為初始蛋白質(zhì)濃度;ct為不同時間的蛋白質(zhì)濃度;V為蛋白質(zhì)溶液體積。

1.4 印跡膜專一選擇性

為檢測印跡膜的專一選擇性,選取Lyz、M b和BSA為參比蛋白。向放置M IP膜及N IP膜的不同燒杯中 ,分別加入10μmol·L-1Lyz溶液、1μmol·L-1M b溶液、1μmo l·L-1BHb溶液、10μmol·L-1BSA溶液各3 m L,4℃下靜置10 h。用紫外分光光度計測其吸光值,并計算重結(jié)合蛋白量（B）。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡膜制備條件的確定

2.1.1 溶劑的選擇

MM A不溶于水,考慮到不同溶劑對聚合反應速率的影響[11],以溶解度和能否成膜為標準,考察DM 2 SO、二甲基甲酰胺（DM F）和甲醇三種溶劑的溶解性及對成膜的影響,結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑的溶解性及對成膜的影響Tab11 Solubility in different solventsand the im pact on the film

由表1可以看出,DMSO與甲醇均具有較好的溶解性,但甲醇無法形成膜狀印跡聚合物;DM SO與DM F均可制備分子印跡膜,但DM F對牛血紅蛋白的溶解能力要小于DM SO。故選擇DM SO作為溶劑。

2.1.2 酯加量的確定

Shea等研究發(fā)現(xiàn),以50%AAc和40%TBAm制得的印跡聚合物重結(jié)合蛋白量大于以5%AAm&AAc和40%TBAm制得的印跡聚合物,即多種功能單體以多種作用力協(xié)同作用時,存在最佳單體配比[10]。

在此以MMA取代部分AAm,在保證功能單體總摩爾數(shù)不變的情況下,研究MMA與AAm的不同配比對印跡膜重結(jié)合蛋白量（便于比較,均指單位面積重結(jié)合量,下同）的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 酯加量對印跡膜重結(jié)合蛋白量的影響Fig.1 Effect of MMA dosage on rebinding protein amount on imprinted membrane

由圖1可知,隨著酯加量的增加,M IP膜重結(jié)合蛋白的量逐漸增加;當酯加量增至25%時,M IP膜重結(jié)合蛋白量達到最大;隨后M IP膜的重結(jié)合蛋白量開始減少。由圖1還可知,隨著酯加量的增加,N IP膜重結(jié)合蛋白量增加不明顯。

實驗發(fā)現(xiàn),隨著酯加量的增加,含酯膜的顏色從無色透明逐漸變?yōu)槿榘咨?剛性也顯著提高。當酯加量超過25%時,膜變得易碎,且不易從玻片揭下來,影響了對模板蛋白的重結(jié)合。

2.1.3 引發(fā)劑用量的確定

引發(fā)劑用量決定引發(fā)體系自由基的量,從而影響聚合度。由于溶劑DM SO造成的阻聚作用[11]以及MMA較低的鏈增長常數(shù)[12],為保證完全聚合需增大引發(fā)劑用量。以無酯印跡膜引發(fā)劑量（0.1 mg·mL-1過硫酸銨 20μL、TEM ED 3μL）為初始引發(fā)劑量,分別提高2～3倍,考察其對含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 引發(fā)劑用量對含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量的影響Fig.2 Effect of in itiator dosage on rebinding protein amount on M IP containing ester

由圖2可以看出,當引發(fā)劑用量為2倍用量時,含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量顯著提高;繼續(xù)增大至3倍用量時,含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量變化不大。這是因為,一方面隨著引發(fā)劑用量的增加,含酯M IP膜聚合度也增加,形成更多的印跡孔穴;另一方面,隨著引發(fā)劑用量的增加,聚合速率也加快,聚合時間縮短,DM 2 SO對蛋白的變性作用也減小,有效印跡孔穴增加,因此,當引發(fā)劑用量為2倍用量時,印跡膜的聚合度已達到最佳,繼續(xù)增大引發(fā)劑用量,重結(jié)合蛋白量無變化。2.1.4 重結(jié)合時間的確定（圖3）

圖3 含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量隨時間變化曲線Fig.3 The change curve of rebinding protein amount on M IP contain ing ester vs.rebinding time

由圖3可見,在最初的0～4 h內(nèi),含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量顯著增加;在4～8 h時,重結(jié)合蛋白量的增加趨緩,8 h后吸附達到平衡。這是因為重結(jié)合時,BHb先與膜表面及淺層印跡孔穴發(fā)生相互作用,由于膜表層空間位阻小,結(jié)合速度快;當淺層的孔穴飽和后,BHb向膜內(nèi)部印跡孔穴擴散,直至達到靜態(tài)吸附平衡,此時空間位阻增大,故結(jié)合速度變慢。因此,為保證含酯M IP膜與BHb充分結(jié)合,后續(xù)實驗中重結(jié)合時間均選擇10 h。

2.1.5 BHb濃度的確定

利用靜態(tài)平衡吸附法在0.1～1.0μmol·L-1濃度范圍內(nèi)進行重結(jié)合,結(jié)果如圖4所示。

由圖 4可知,當BHb濃度在 0.1～0.4μmol·L-1范圍內(nèi),重結(jié)合蛋白量顯著增加;當BHb濃度在0.4～0.8μmol·L-1范圍內(nèi) ,增速變緩;當 BHb 濃度超過0.8μmol·L-1時,重結(jié)合蛋白量達到飽和。因此,為保證含酯M IP膜與BHb充分結(jié)合,后續(xù)實驗中BHb濃度均選擇1.0μmol·L-1。

2.2 選擇性吸附

圖4 含酯M IP膜在不同BHb濃度下重結(jié)合蛋白量Fig.4 Rebinding protein amoun t on M IP contain ing ester at different concentrations of BHb

3種參比蛋白中,溶菌酶（Lyz）作為分子量小、體積小的參比蛋白的代表;肌紅蛋白（M b）作為分子量小、體積小但具有類似于模板蛋白結(jié)構(gòu)的參比蛋白的代表;牛血清蛋白（BSA）作為分子量略大、體積近似于模板蛋白的參比蛋白的代表。結(jié)果表明,含酯M IP膜對模板蛋白 BHb具有相對較高的重結(jié)合蛋白量,Lyz、M b、BSA的重結(jié)合蛋白量遠小于模板蛋白,這表明含酯M IP膜具有一定的選擇性。含酯 NIP膜對4種蛋白的重結(jié)合蛋白量較為接近,沒有選擇性。

以印跡影響因子α來評價印跡膜的專一選擇性。

顯然,α值越大,表明M IP膜相對于N IP膜對客體分子的識別性越好。

將含酯印跡膜與無酯印跡膜對4種蛋白的重結(jié)合量進行對比,結(jié)果如圖5和表2所示。

圖5 含酯印跡膜和無酯印跡膜對不同蛋白重結(jié)合蛋白量的對比Fig.5 Contrast of rebinding amoun t of different protein on im printed membrane with ester or without ester

表2 含酯印跡膜和無酯印跡膜對不同蛋白的α值Tab12 The values ofαof different proteins on imprinted membrane with ester or without ester

由圖5和表2可知,隨著疏水性功能單體MM A的引入,印跡膜對模板蛋白的重結(jié)合量顯著增加,α值也隨之增加,這說明印跡膜的專一選擇性得到了提高,這與Shea等的結(jié)果相符合[10]。隨著選擇性的提高（MMA的引入）,3種參比蛋白的α值都有一定程度的降低。尤其是M b,其含酯M IP膜的重結(jié)合蛋白量明顯減少。這可能是由于引入疏水性功能單體后,通過氫鍵和疏水作用力的協(xié)同作用,提高了含酯印跡膜的專一選擇性,可正確識別模板蛋白BHb與其結(jié)構(gòu)類似的蛋白M b。

3 結(jié)論

引入疏水性功能單體MMA后,通過與丙烯酰胺的協(xié)同作用,所制備的含酯印跡膜對模板蛋白BHb的專一選擇性明顯提高,尤其是對結(jié)構(gòu)類似蛋白M b的識別能力得到了提高。該法為有效提高蛋白質(zhì)等生物大分子的印跡聚合物的專一選擇性提供了一條新的途徑。

[1] Watabe Y,Kondo T,Morita M,et al.Determination of bisphe2 nol A in environmental water at ultra2low level by high2perform2 ance liquid chromatography w ith an effective on2line p retreatment device[J].J Chromatogr A,2004,1032（122）：45249.

[2] Sambe H,Hoshina K,Hosoya K,et al.Direct injection analysis of bisphenol A in serum by combination of isotope imp rinting w ith liquid chromatography2mass spectrometry[J].Analyst,2005,130（1）：38240.

[3] Kaw aguchi M,Hayatsu Y,Nakata H,et al.Molecularly imp rin2 ted solid phase extraction using stable isotope labeled compounds as temp late and liquid chromatography2mass spectrometry for trace analysis of bisphenol A in w ater samp le[J].Anal Chim Ac2 ta,2005,539（122）：83289.

[4] Wang Yantian,Zhou Yanxiu,Sokolov J,et al.A potentiometric p rotein sensor built with surfacemolecular imp rintingmethod[J].Biosensors and Bioelectronics,2008,24（1）：1622166.

[5] Yoshida M,Hatate Y,Uezu K,et al.Chiral2recognition polymer p repared by surface molecular imp rinting technique[J].Colloid Surf A,2000,169（123）：2592269.

[6] Yoshida M,Uezu K,Goto M,et al.Surface imp rinted polymers recognizing amino acid chirality[J].J App l Polym Sci,2000,78（4）：6952703.

[7] Yoshida M,Hatate Y,Uezu K,et al.Metal2imp rinted micro2 sphere p repared by surface template polymerization and its appli2 cation to chromatography[J].J Polym Sci,2000,38（4）：6892696.

[8] Guo Min2Jie,Zhao Zhuo,Fan Yun2Ge,et al.Protein2imp rinted po2 lymer w ith immobilized assistant recognition polymer chains[J].Biomaterials,2006,27（24）：438124387.

[9] Long Yi,Xing Xiao2Cui,Han R,et al.Two2step purification of low2content cellular p rotein using p rotein2imp rinted polymers[J].Analytical Biochemistry,2008,380（2）：2682275.

[10] Hoshino Y,Kodama T,Okahata Y,et al.Peptide imp rinted pol2 ymer nanoparticles：A plastic antibody[J].J Am Chem Soc,2008,130（46）：15242215243.

[11] Thomoson R A M.Method of Polymerization for Prepararion of Water2soluble Polymers.In：Finch C A.Chemistry and Tech2 nology of Water2soluble Polymers[M].New York：Plenum Press,1983：27235.

[12] 方道斌,郭睿威,哈潤華,等.丙烯酰胺聚合物[M].北京：化學工業(yè)出版社,2006：1582167.

Preparation of Hemoglobin M olecular Imprinted Membrane Contain ing Ester

D ING An2zi,FANG Gui2jie,GAO Qin,XIEWei2hong
（Key L aboratory of Fermentation Engineering for M inistry of Education,College of B ioengineering,H ubei University of Technology,W uhan430068,China）

By aqueous solution polymerization,the bovine hemoglobin molecular imp rinted membraneswere synthesized w ith acrylamide and methylmethacrylate as the functionalmonomers,N,N′2methylenebisacrylam2 ide as the crosslinker,and bovine hemoglobin as the temp late.The results showed that the specific selectivity of bovine hemoglobin molecular imp rinted membrane was significantly increased by introducing hydrophobic monomer methylmethacrylate into the polymer.The increase of the selectivity was due to the cooperation of hydrogen bonding and hydrophobic action.

p rotein molecular imp rinted membrane;bovine hemoglobin;multisite interaction

O 641.3

A

1672-5425（2010）06-0024-04

國家自然科學基金資助項目（20875024/B0509）,湖北省教育廳重大研究項目（Z20081402）

2010-04-19

丁安子（1982-）,男,湖北人,碩士研究生,研究方向：生物化工;通訊作者：謝衛(wèi)紅,博士,教授。