周曉明,莫雋穎,陶 冶,付水林,宮 衡

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237）

黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達

周曉明,莫雋穎,陶 冶,付水林,宮 衡

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237）

根據(jù) GenBank報道的黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因序列設計兩對特異性引物,分別以黑曲霉 H7總 RNA及基因組DNA為模板,擴增出β2葡萄糖苷酶基因bg l全長及活性中心所在的外顯子5序列E5,分別將其連接到pMD182T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α測序。結(jié)果表明,bg l序列全長2583 bp,與β2葡萄糖苷酶基因（XM 001398779.1）核苷酸序列同源性為99%,氨基酸序列同源性為99%,E5與bg l外顯子5區(qū)域同源性為100%。進一步構(gòu)建表達質(zhì)粒p ET32a（+）2bg l、p ET32a（+）2E5、p ET28a（+）2E5,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21（DE3）誘導表達,并進行 SDS2PAGE電泳分析。

黑曲霉;β2葡萄糖苷酶;序列分析;蛋白表達

β2葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）屬于糖苷水解酶家族3,是纖維素酶系的重要組成部分,但其含量最低,不足1%,且活性普遍偏低,是纖維素酶解轉(zhuǎn)化的瓶頸[1]。因此許多國內(nèi)外學者正致力于β2葡萄糖苷酶分子生物學方面的研究,以期改善纖維素酶的催化效率,實現(xiàn)纖維素資源的高效生物轉(zhuǎn)化。研究表明,黑曲霉是β2葡萄糖苷酶酶活較高的菌株[2,3],但關(guān)于黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因的研究報道仍然較少[4～7]。作者在此分別以黑曲霉（A.niger）H7總RNA及基因組DNA為模板,擴增β2葡萄糖苷酶基因bg l全長以及活性中心所在的外顯子5序列E5,并分別將兩段序列構(gòu)建到表達載體p ET32a（+）及p ET28a（+）上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進行誘導表達,為研究黑曲霉β2葡萄糖苷酶的重組表達奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌株與質(zhì)粒

A.nigerH 7,自行篩選;E.coliDH 5α、E.coliBL 21（DE3）、p ET32a（+）、p ET28a（+）,自行保存 ;克隆載體pMD182T,大連寶生物公司。

1.2 工具酶及主要試劑

總RNA提取試劑、焦碳酸二乙酯（DEPC）、DNA MarkerⅢ、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,北京天根公司;ExTaq DNA聚合酶、X2Gal、IPTG、PrimeScrip t RT Reagent試劑盒,大連寶生物公司;T4連接酶、BamH I、N otI限制性內(nèi)切酶,Fer2 mentas公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1（將馬鈴薯切成1 cm3方塊,置于1000 mL水中煮沸,過濾收集液體,即得）,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂粉 15 g·L-1。

1.4 黑曲霉總 RNA及基因組DNA的抽提

黑曲霉總RNA抽提采用 Trizol法,起始菌體量為500 mg,具體步驟參照說明書。抽提結(jié)束后用紫外分光光度計測定其OD230、OD260、OD280,并進行瓊脂糖凝膠電泳。

黑曲霉基因組DNA抽提采用CTAB法,具體步驟參照文獻[8]。

1.5 引物設計

以 GenBank上已經(jīng)發(fā)表的黑曲霉β2葡萄糖苷酶基因序列bgl 1（登錄號為AJ132386）為模板設計兩對特異性引物,擴增bg l全長的上游引物為 bgl2F：5′2 CGGGA TCC A TGAGGTTCACTTTGA TCGAGGC2 3′,下游引 物為 bgl2R：5′2A TTTGCGGCCGC AGT2 GAACA GTAGGCA GAGACGCC23′,采用的限制性酶切位點（劃線部分）分別為上游BamHI和下游NotI。擴增外顯子 5的上游引物為 E52F：5′2CGG2 GA TCCTCCGACTACAACTCTGCTTTCCCT23′,下游 引 物 為 E52R：5′2A TTTGCGGCCGCTGGCG2 GTCTTAGCAAGCGCCTCAA T23′。引物由上海生工公司合成。

1.6 目的片段的擴增

cDNA第一條鏈的合成：冰上取總 RNA 5μL、Oligo d T 0.5μL、Random Primer 1μL、RNase2free H2O 3.5μL于65℃保溫10 min,加入5×RT Buffer 4μL、RNase2free H2O 5μL、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL,于42℃保溫1 h后85℃滅活5 min。將20μL體系用dd H2O稀釋至50μL,于-20℃保存。

PCR擴增全長（50μL體系）：10×ExTaq Buffer 5.0μL,dN TP 4.0μL,上游引物 1.0μL,下游引物1.0μL,cDNA第一條鏈 10.0μL,TaKaRaExTaq HS Enzyme 0.5μL,ddH2O 28.5μL補足。反應條件為：94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 3 min,35個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。E5片段擴增方法同上,采用基因組DNA為模板,退火溫度為59℃,延伸90 s。

將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對目的條帶進行膠回收。

1.7 TA克隆

將上述純化的PCR擴增產(chǎn)物與Ta KaRa pMD182 T載體連接,10μL連接體系如下：1μL pMD182T載體,4μL目的片段、5μL Solution I,16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,用含有 X2Gal、IPTG和100μg·m L-1Amp的LB平板篩選陽性克隆,對篩選到的轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒并進行PCR或雙酶切驗證。對鑒定正確的克隆進行測序,測序結(jié)果登陸NCB I網(wǎng)站進行BLAST比對分析。

1.8 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述測序正確的質(zhì)粒用BamH I和N otI雙酶切后,與同樣雙酶切的表達載體連接,采用 T4 DNA連接酶,連接體系為：表達載體3.0μL,目的片段9.0 μL,5×Ligase Buffer 4.0μL,T4 DNA Ligase 1.0 μL,ddH2O 3.0μL補足至20.0μL。22℃連接6 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,并用含有100μg·m L-1Amp的LB平板進行篩選。對陽性轉(zhuǎn)化子進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的陽性克隆分別命名為p ET32a（+）2bg l、p ET32a（+）2E5、p ET28a（+）2E5,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL 21（DE3）感受態(tài)細胞中。

1.9 目的蛋白的誘導表達

從新鮮的LB平板上挑取重組菌菌落,接種于25 m L帶有相應抗性的 LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng),以1%的比例接種到30 m L抗性LB培養(yǎng)基,37℃、200 r·m in-1培養(yǎng)至OD600約為0.4～0.5時,加入終濃度為1 mmol·L-1的 IPTG,30℃誘導表達約4 h。取1 m L菌液,12 000 r·min-1離心2 min,收集菌體,用 PBS緩沖溶液（p H值7.0）洗滌沉淀1～2次,并最終將其溶于500μL相同緩沖溶液中。超聲破碎細胞：功率200 W,每超聲2 s間隔4 s,共60次。4℃、12 000 r·min-1離心30 min,分別取上清與沉淀溶于相同的緩沖溶液中,以誘導前的重組菌株為對照進行SDS2PAGE電泳,分析重組蛋白表達情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉總 RNA及基因組DNA的提取（圖1）

圖1 黑曲霉總 RNA（a）和黑曲霉基因組DNA（b）Fig.1 Total RNA（a）and Genome DNA（b）of Aspergillus niger H7

由圖1可以看出,抽提的黑曲霉總 RNA經(jīng)電泳后28 S和18 S條帶清晰,無拖尾,5 S部分降解較少,說明RNA完整性好,且28 S亮度比18 S略高,雖不能完全達到2∶1的比例,但仍可作為模板進行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄實驗。經(jīng)紫外分光光度計檢測,RNA樣品的OD260/OD280均值為 1.942、OD260/OD230均值為2.061,說明抽提的總RNA完整性較好,純度高,雖然有少量被降解的跡象,仍然能夠滿足后續(xù)RT2PCR的要求。

2.2 目的片段的擴增（圖2）

圖2 RT2PCR擴增 bg l（a）和PCR擴增 E5（b）Fig.2 RT2PCRamplification of bgl（a）and PCR product of E5（b）

由圖2可以看出,擴增出的bg l片段大小約為2600 bp,E5片段大小約為1200 bp,分別與理論值2583 bp及1192 bp相符,初步認定是目的基因。

2.3 重組克隆載體的鑒定（圖3）

圖3 pMD182T2bgl的 PCR驗證（a）和pMD182T2E5的雙酶切驗證（b）Fig.3 Identification of pMD182T2bgl by PCR（a）and pMD182T2E5 by double digestion（b）

由圖3可以看出,經(jīng) PCR擴增后,pMD182T2bgl能夠得到與目的片段大小相符的特異性條帶,pMD182T2E5雙酶切后產(chǎn)生的兩個條帶分別與載體及目的片段大小相對應,表明bgl與E5已經(jīng)成功克隆至 T載體。

2.4 bgl基因的序列測定及分析

對鑒定正確的重組菌株進行測序,結(jié)果顯示bg l片段大小為2583 bp,其中 A 543個、T 579個、C 705個、G 756個、G+C為 56.56%。登錄 NCB I進行BLAST比對,結(jié)果顯示目的基因與4個分別來源于Aspergillus nigerNRRL3135（登錄號 FN430671.1）、A s3.350（DQ 655704.1）、zju22（FJ262991.1）,CBS513.88（XM 001398779.1）菌株及一個Aspergil2lus niger未知菌株（EU 233788.1）的β2葡萄糖苷酶m RNA序列同源性高達99%,氨基酸序列同源性為99%。與CBS513.88相比,bg l核苷酸序列共有18處堿基不同,其中12處對應的氨基酸序列未發(fā)生改變。

Bause等[9]提出糖苷水解酶家族3中成熟肽的第261位氨基酸A sp（D261）作為該酶的催化親核位點是高度保守的,并且其周圍氨基酸VM SDW也是高度保守序列。以DNA為模板擴增的E5序列正是包含該活性位點的區(qū)域,測序結(jié)果表明其氨基酸序列特征與上述報道完全一致,將其與全長測序結(jié)果比對,外顯子5區(qū)域同源性達100%。

第三個研究問題旨在探索把英語作為二語或外語學習的大學生的詞匯量與語言能力之間的相關(guān)性。相關(guān)性分析結(jié)果表明，除中高級水平受試者的控制產(chǎn)出性詞匯知識量與其語言能力存在相關(guān)性以外，其它各變量間并無顯著相關(guān)性。對此有兩種可能的解釋：一種可能性是測量工具本身，可能還沒有在不同的層次之間進行足夠的區(qū)分。另一種可能是因為學生的詞匯量非常接近。因此，這一結(jié)論排除了將詞匯量測試作為獨立評估工具，來作為我們這樣的教學背景下語言能力水平指標的可能性。然而，詞匯量測試的結(jié)果也可用于教學目的。通過調(diào)查學生的二語或外語詞匯知識，將為學生提供一個更合適的教學計劃，以提高他們的詞匯能力。

在 PROSITE數(shù)據(jù)庫中（http：//www.expasy.o rg/p rosite）搜索目的蛋白功能結(jié)構(gòu)位點,結(jié)果表明其成熟肽（去除1～19信號肽序列）247～264位序列為LL KAELGFQGFVM SDWAA,其中第 261位為 A sp（D）,與文獻報道相一致,進一步表明該酶是糖苷水解酶家族3成員。在線采用 PROTPARAM程序（ht2 tp：//expasy.org/cgi2bin/p rotparam）預測其編碼蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果表明其可編碼860個氨基酸的蛋白質(zhì),目的蛋白大小預計為93.3 kD,理論p I值為4.60,酸性氨基酸殘基總數(shù)（A sp+Glu）為100,堿性氨基酸（A rg+Lys）為60,表明其為酸性蛋白質(zhì)。20種氨基酸中甘氨酸（Gly）含量最高,為10.5%;丙氨酸（A la）次之,為9.7%。

2.5 重組表達載體的酶切鑒定（圖4）

圖 4 pET32a（+）2bgl（a）和 pET32a（+）2E5、pET28a（+）2E5（b）的雙酶切驗證Fig.4 Identification of pET32a（+）2bgl（a）and pET32a（+）2E5,pET28a（+）2E5（b）by double digestion

由圖4可以看出,經(jīng)BamH I及N otI雙酶切后,三個重組質(zhì)粒均能獲得兩個特異性條帶,大小分別與目的片段及載體相符,表明目的基因已成功構(gòu)建到表達載體。

2.6 重組蛋白的表達

經(jīng)優(yōu)化表達條件,最終獲得目的蛋白最優(yōu)誘導表達條件為：20℃下用0.5 mmol·L-1IPTG誘導表達12 h。SDS2PAGE電泳結(jié)果顯示,含有p ET32a（+）2bg l、p ET32a（+）2E5、p ET28a（+）2E5 的重組菌能夠產(chǎn)生特異性條帶,形成分子量約為114 kD、63 kD及48.9 kD的目的蛋白,與理論值93.3 kD和43.6 kD有差異,這是由于p ET32a（+）、p ET28a（+）質(zhì)粒本身分別帶有 Trx和/或 His標簽序列,其編碼的蛋白與目的蛋白融合表達的結(jié)果。而未經(jīng)誘導的重組菌并沒有目的蛋白的表達。經(jīng) Gel2p ro軟件分析,BGL目的蛋白含量約占總蛋白的32.14%。

經(jīng)超聲破碎之后,BGL蛋白大部分以包涵體形式存在于沉淀中,上清中只有少量蛋白表達,見圖5。

M.Molecular massmarker 1,4,7,10.p ET28a（+）2E5誘導前及誘導后全菌體、上清、沉淀 2,5,8,11.p ET32a（+）2E5誘導前及誘導后全菌體、上清、沉淀 3,6,9,12.p ET32a（+）2bg l誘導前及誘導后全菌體、上清、沉淀

3 結(jié)論

（2）測序結(jié)果表明,bg l全長2583 bp,推測其可編碼一個860個氨基酸的蛋白質(zhì),與β2葡萄糖苷酶基因（XM 001398779.1）核苷酸序列同源性為99%,氨基酸序列同源性為99%,屬于糖苷水解酶家族3,DNA上E5序列與bg l外顯子5部分同源性達100%。

（3）將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導表達,能夠成功獲得與預期大小相一致的融合蛋白。經(jīng)超聲破碎后,BGL蛋白大多以包涵體形式存在,上清中僅有少量蛋白,E5蛋白則完全以包涵體形式存在于沉淀中。

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Clon ing and Expression of Aspergillus N igerβ2Glucosidase Gene in Escherichia Coli

ZHOU Xiao2m ing,MO Jun2ying,TAO Ye,FU Shui2lin,GONG Heng（State Key L ab of B ioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China）

Acco rding to the sequence ofAspergillus nigerβ2glucosidase gene published in GenBank,two pairs of specific p rimers were designed and synthesized.Using the total RNA and genome DNA ofAspergillus nigerH7 as template,bg lgene and exon 5 sequence were amp lified.PCR p roduct were then cloned into pMD182T vector and sequenced,the results showed the nucleoside sequence ofbg lwas2583 bp,the homology of target gene and its deduced am ino acid sequence to the published could reach 99%and 99%,respectively.E5 sequence w as 100%identical to the exon 5 region ofbg l.Then the exp ression vecto rs p ET32a（+）2bg l,p ET32a（+）2E5,p ET28a（+）2E5 w ere constructed and transfo rmed intoEscherichia coliBL 21（DE3）.The recom bi2 nant strains w ere induced by 1 mmo l·L-1IPTG and the target p roteins w ere analyzed by SDS2PA GE.

Aspergillus niger;β2glucosidase;sequence analysis;p rotein exp ression

Q 786

A

1672-5425（2010）06-0050-04

2010-04-12

周曉明（1985-）,女,江蘇連云港人,碩士研究生,研究方向：分子生物學;通訊作者：宮衡,教授。E2mail：gongheng@ec2 ust.edu.cn。