孔冬梅

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原，030006)

重瓣葵黃色素超聲提取工藝*

孔冬梅

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原，030006)

對(duì)重瓣葵花瓣黃色素的提取工藝進(jìn)行了探索，旨在開(kāi)發(fā)新的天然色素資源，為工業(yè)化提取重瓣葵黃色素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用超聲有機(jī)溶劑浸提，以提取液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度表示提取效果。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法，建立了提取溫度、液料比、提取劑濃度與提取效果之間的經(jīng)驗(yàn)數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明:適宜提取工藝條件為提取溫度50℃、液料比40∶1(mL∶g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲處理15 min，恒溫浸提3 h，在此條件下，重瓣葵黃色素提取液的吸光度為0.781。

重瓣葵，黃色素，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，超聲提取

重瓣葵(Helianthus annuus var.nanus flore-pleno)是菊科向日葵(H.annuus)的變種，為多年生宿根草本花卉，原產(chǎn)北美，近年引入我國(guó)并試種成功，現(xiàn)已廣泛栽培。重瓣葵頭狀花序生于枝端，球形碩大，直徑達(dá)30cm，開(kāi)花數(shù)量多，花期長(zhǎng)，花瓣金黃，色彩艷麗，可用于提取色素［1－5］。本試驗(yàn)采用超聲有機(jī)溶劑浸提，并設(shè)計(jì)了二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)，對(duì)重瓣葵黃色素的提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 材料、儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

重瓣葵花瓣，采自吉林白城師范學(xué)院校園，經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)呂晉慧副教授鑒定，干燥粉碎后過(guò)40目篩的樣品作為實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2 主要儀器

722型光柵分光光度計(jì)(上海精科)，恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)，MT/FA系列電子分析天平(北京美泰科儀檢測(cè)儀器有限公司)，250H超聲波清洗器(800W)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，樣品篩等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇、異丙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、石油醚(天津化學(xué)試劑有限公司，均為分析純?cè)噭?。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取方法

重瓣葵黃色素提取工藝流程如下:

花瓣干粉浸入一定體積的提取液→超聲處理→溶劑浸提→離心→色素液(定容到一定體積，4℃保存)

2.2 波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g，用30mL無(wú)水乙醇浸提，800 W功率超聲處理15 min后，室溫振蕩3 h，離心。取5mL浸提液，放入1cm比色杯，測(cè)定可見(jiàn)光區(qū)不同波長(zhǎng)下的吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)λmax。文中實(shí)驗(yàn)以最大波長(zhǎng)測(cè)樣品。超聲處理下同。

2.3 提取劑的選擇

選用蒸餾水、無(wú)水乙醇、異丙醇、丙酮、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、石油醚等極性不同的8種溶劑進(jìn)行浸提試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取樣品8份，每份1.0 g，分別放入100mL三角瓶中，依次加入30mL溶劑，超聲后室溫振蕩浸提3 h。離心，定容提取液至50mL，在最大波長(zhǎng)下測(cè)浸提液吸光度。

2.4 乙醇濃度對(duì)色素提取的影響

配制體積分?jǐn)?shù) 50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，準(zhǔn)確稱取樣品6份，每份0.5 g，放入100mL三角瓶中。依次加入30mL不同濃度的乙醇溶液，超聲后室溫振蕩浸提3 h，離心后定容至50mL。在λmax下用分光光度計(jì)測(cè)量浸提液吸光度。

2.5 提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品7份，每份0.2 g，放入100mL三角瓶中，分別加入70%乙醇10mL。超聲后室溫振蕩浸提，每隔30 min離心一份，定容到10mL，在λmax下用分光光度計(jì)測(cè)量提取液吸光度。

2.6 提取溫度對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品每份0.2 g，加入到11個(gè)三角瓶中，分別加入70%乙醇10mL，并依次調(diào)整溫度為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃，超聲后恒溫水浴振蕩1 h，離心后上清液定容到10mL，在λmax下用分光光度計(jì)測(cè)量提取液吸光度。

2.7 液料比對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品5份，每份1.0 g，加入到三角瓶中，分別加入 70% 乙醇 10、20、30、40、50mL，超聲后，35℃下恒溫水浴振蕩1 h，離心后上清液定容到50mL，在λmax下用分光光度計(jì)測(cè)量提取液吸光度。

為了使重瓣葵黃色素的吸光度達(dá)到最大，在預(yù)先單因素試驗(yàn)與觀察的基礎(chǔ)上，利用超聲處理浸提物15 min后，恒溫振蕩浸提3 h，設(shè)計(jì)三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)(表1)。

2.8 提取工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平編碼表

3個(gè)單因素分別為溫度、液料比、乙醇濃度3個(gè)外界因子，為自變量，分別以 X1、X2、X3表示，并以 +1、0、－1 分別代表自變量的高、中、低水平［6］。采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、回歸方程的推導(dǎo)以及方差分析、兩因素交互效應(yīng)曲面的制作，進(jìn)而研究各因素對(duì)重瓣葵花瓣黃色素提取液吸光度影響的規(guī)律。

3 結(jié)果與分析

3.1 波長(zhǎng)的確定

重瓣葵黃色素浸提液在可見(jiàn)光區(qū)的吸收曲線如圖1所示。由圖1曲線可看出，在280 nm處和440 nm處出現(xiàn)了2個(gè)吸收峰，在440 nm處達(dá)到了最大吸光度OD，故最大吸收波長(zhǎng)確定為440 nm，即λmax為440 nm。

3.2 浸提劑的選擇

浸提實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超聲15 min，在3 h內(nèi)提取后，重瓣葵花瓣黃色素在各種溶劑中的溶解度不同(如圖2)。在異丙醇中溶解度最大，測(cè)得的OD值為1.372，其次為丙酮、無(wú)水乙醇和乙醚。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)這4種提取液之間OD值差異不顯著。可見(jiàn)重瓣葵黃色素為水溶性色素，易溶于極性較強(qiáng)的溶劑。重瓣葵黃色素在異丙醇、丙酮中溶解度均稍高于無(wú)水乙醇，但異丙醇不易揮發(fā)，殘留在色素液中不易去除;丙酮雖易揮發(fā)，但人體吸入后易引起不適反應(yīng)。乙醚揮發(fā)性也較強(qiáng)，但其異味和毒性較大，故在生產(chǎn)中一般不采用。而無(wú)水乙醇揮發(fā)性好，無(wú)毒無(wú)殘留，據(jù)此確定選擇乙醇作為浸提劑較合適。

圖1 重瓣葵黃色素浸提液在可見(jiàn)光區(qū)的吸收曲線

圖2 提取劑對(duì)色素提取的影響

3.3 乙醇濃度對(duì)色素提取的影響

從圖3可知，乙醇在體積分?jǐn)?shù)為50%～60%內(nèi)，重瓣葵黃色素的吸光度明顯低于乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%以上的吸光度;乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～100%時(shí)，以無(wú)水乙醇的浸提效果最優(yōu)，其余依次為70% ＞90% ＞80%，單因素方差分析表明70%、80%、90%3種乙醇濃度間提取效果無(wú)顯著性差異。而與不同濃度的乙醇相比，無(wú)水乙醇更易揮發(fā)，不易控制，且成本較高，因而在生產(chǎn)中較少用。

圖3 乙醇濃度對(duì)色素提取的影響

3.4 浸提時(shí)間對(duì)色素提取的影響

由圖4可看出，在30～210 min內(nèi)，吸光度隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在30～170 min內(nèi)吸光度增加較明顯;在170～210 min內(nèi)，吸光度增加不明顯，趨于平緩;浸提180 min已達(dá)到最大吸光度，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度無(wú)明顯增加。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)色素提取的影響

3.5 浸提溫度對(duì)色素提取的影響

如圖5所示，在低于50℃時(shí)，浸提液吸光度隨提取溫度升高而增加，在50℃時(shí)的吸光度達(dá)到最大值0.715;當(dāng)浸提溫度高于50℃時(shí)，隨溫度的逐漸提高，吸光度沒(méi)有增加的趨勢(shì)。

圖5 浸提溫度對(duì)色素提取的影響

3.6 浸提液料比對(duì)色素提取的影響

由圖6可知，液料比在10∶1～50∶1內(nèi)，隨液料比的升高，提取液的吸光度呈先升高后降低的趨勢(shì)，在40∶1處有一個(gè)最高峰值。

圖6 液料比對(duì)色素提取的影響

3.7 提取工藝條件優(yōu)化

3.7.1 回歸模型的建立和檢驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，共設(shè)計(jì)出23個(gè)處理組，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果利用DPS軟件進(jìn)行分析，得到重瓣葵黃色素提取液的吸光度(Y)與溫度(X1)、液料比(X2)、乙醇濃度(X3)三因素在編碼空間的多元回歸模型如下:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.030 84X3+0.002 61X12－0.014 36X22－0.032 21X32－0.007 50X1X2－0.033 50X1X3－0.023 00X2X3

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及結(jié)果

對(duì)回歸方程的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，失擬性檢驗(yàn) F1=6.585，小于F0.01(5，8)=6.63，不顯著，表明失擬平方和其他不可忽略的因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響很小，說(shuō)明所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)??；貧w方程顯著性檢驗(yàn)F2=136.950，大于 F0.01(9，13)=4.19，表明回歸方程達(dá)到極顯著，反應(yīng)出方程式在試驗(yàn)點(diǎn)上與試驗(yàn)結(jié)果相吻合，模型成立。

對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，在α=0.1顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)，得到簡(jiǎn)化后的方程為:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.030 84X3－0.014 36X22－0.032 21X32－0.007 50X1X2－0.033 50X1X3－0.023 00X2X3

表3 回歸模擬的方差分析表

3.7.2 主因子效應(yīng)分析

從表3可以得出:MS X1=0.090 7;MS X2=0.007 5;MS X3=0.013 0。所以，影響重瓣葵黃色素提取的3個(gè)因素主次順序是:提取溫度＞乙醇濃度＞液料比。

3.7.3 單因子效應(yīng)分析

從圖7可以看出，各個(gè)曲線的變化趨勢(shì)與試驗(yàn)所做的單因素曲線圖趨勢(shì)基本吻合。這一現(xiàn)象表明，提取溫度、液料比和提取溶劑濃度對(duì)重瓣葵黃色素提取的影響趨勢(shì)與單因素所反映的基本一致，可為日后生產(chǎn)放大選擇參數(shù)提供一定的依據(jù)。

3.7.4 互作效應(yīng)分析

固定方程中的一個(gè)因素，可得出另2因素與重瓣葵黃色素吸光度關(guān)系的子模型。根據(jù)二次回歸方程，建立響應(yīng)曲面圖，可以直觀地反映交互對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖7)。

圖7 單因子效應(yīng)分析圖

3.7.4.1 提取溫度和液料比交互作用對(duì)吸光度的影響

將乙醇體積分?jǐn)?shù)X3固定在零水平，得到液料比X2和溫度X1對(duì)吸光度Y的影響方程:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.002 61X12－0.014 36X22－0.007 50X1X2

從圖8可以看出，當(dāng)固定乙醇濃度時(shí)，隨著溫度的增加，色素提取液吸光度增加，尤其在35～50℃吸光度增加較快;在任何溫度水平，吸光度隨液料比的增加基本呈上升趨勢(shì)，但變化速度較慢。當(dāng)溫度在45～50℃，液料比在30∶1～40∶1時(shí)，吸光度處在一個(gè)較高水平。

圖8 提取溫度和液料比交互作用對(duì)色素提取的影響

3.7.4.2 溫度和乙醇濃度交互作用對(duì)吸光度的影響

將液料比X2固定在零水平，得到溫度X1和乙醇濃度X3對(duì)吸光度Y的影響方程:

Y=0.629 19+0.081 48X1+0.030 84X3+0.002 61X12－0.032 21X32－0.033 50X1X3

從圖9可以看出，當(dāng)固定液料比時(shí)，吸光度隨溫度的增加呈上升趨勢(shì);在較低溫度范圍內(nèi)時(shí)，吸光度隨乙醇濃度的增加而增加，而在較高溫度范圍內(nèi)時(shí)，吸光度隨乙醇濃度的增加呈拋物線的變化，表明乙醇濃度只有在一個(gè)適中的范圍才能使吸光度達(dá)到最大?？偟膩?lái)說(shuō)，當(dāng)溫度在50℃左右，乙醇體積分?jǐn)?shù)在65%～70%時(shí)，吸光度處在較高水平。

圖9 溫度和乙醇濃度交互作用對(duì)色素提取的影響

3.7.4.3 液料比和乙醇濃度交互作用對(duì)吸光度的影響

將溫度X1固定在零水平，得到液料比X2和乙醇濃度X3對(duì)吸光度Y的影響方程:

Y=0.629 19－0.023 46X2+0.030 84X3－0.014 36X22－0.032 21X32－0.023 00X2X3

從圖10可以看出，當(dāng)固定溫度時(shí)，在較低乙醇濃度范圍內(nèi)，吸光度隨液料比的增加呈不明顯的拋物線變化，在較高乙醇濃度范圍內(nèi)，吸光度隨液料比的增加而增加;在較低液料比時(shí)，吸光度隨乙醇濃度增加呈不明顯的拋物線變化，在較高液料比時(shí)，吸光度隨乙醇濃度的增加基本上呈增加趨勢(shì)。只有當(dāng)液料比和乙醇濃度均取值適中時(shí)，才會(huì)獲得最大吸光度。圖中顯示，液料比在35∶1～40∶1，乙醇濃度在70%～80%時(shí)，吸光度處于較高水平。

圖10 液料比和乙醇濃度交互作用對(duì)色素提取的影響

3.7.5 最適工藝條件的選擇

以0.60作為吸光度的臨界值，大于0.60的53個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中各變量的取值頻率分布如表4所示。由表4結(jié)合預(yù)先的單因素試驗(yàn)分析，確定最佳提取工藝條件為溫度50℃、液料比40∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下的黃色素吸光度的預(yù)測(cè)值為0.790。對(duì)這一組合進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，得到實(shí)測(cè)平均值為0.781，模型誤差為1.15%，表明模型擬合較好，回歸方程可靠。

表4 提取液吸光度大于0.60的53個(gè)方案

4 結(jié)論

(1)在預(yù)先單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法對(duì)重瓣葵黃色素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了提取液吸光度Y與溫度X1、液料比X2和乙醇濃度X3之間的回歸模型為:

Y=0.629 19+0.081 48X1－0.023 46X2+0.030 84X3+0.002 61X12－0.014 36X22－0.032 21X32－0.007 50X1X2－0.033 50X1X3－0.023 00X2X3

(2)根據(jù)模擬結(jié)果確定3個(gè)因素對(duì)重瓣葵花瓣黃色素提取效果的影響大小依次為提取溫度＞乙醇濃度＞液料比;最佳提取工藝條件為液料比40∶1、溫度50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下黃色素提取液吸光度的模擬值為0.790，實(shí)測(cè)值為0.781;通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，該模型與實(shí)際情況吻合良好，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

(3)重瓣葵花瓣黃色素為水溶性色素，尤其在無(wú)水乙醇、異丙醇、丙酮中溶解度最大，在乙醚中溶解度也較大。有關(guān)重瓣葵黃色素的功能活性及其他理化性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

致謝:感謝吉林白城師范學(xué)院叢建民博士在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析中給予的幫助。

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Study on Ultrasonic Extraction of Yellow Pigment from Sunflower

Kong Dong-mei
(College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006 China)

Extraction process of the yellow pigment from sunflower(Helianthus annuus var.nanus flore-pleno)was optimized on the basis of the preliminary exploration.The study was designed to provide a theoretical basis for the development of new pigment resources and the industrialized extraction.Organic solvent extraction was carried out.Extraction effect was represented with the absorbance of extracting solution under the maximum absorption wavelength.Quadratic regression orthogonal rotary tests were designed on the basis of single factor experiments.And the mathematical model of correlation among temperature，ratio of solvent to material，concentration of solvent and extraction effect was established.The results showed that the optimum extraction conditions were:the ratio of solvent to material 40∶1(mL∶g)with 70%ethanol，ultrasound treatment 15 min，extraction time 3 h under the constant temperature of 50℃.Under the above conditions，the absorbance of the yellow pigment was 0.781.

Helianthus annuus var.nanus flore-pleno，yellow pigment，quadratic regression orthogonal rotary tests，ultrasonic extraction

博士，講師。

*山西大學(xué)青年科技基金(2007108)

2010－07－15，改回日期:2010－09－15