王英，張玉剛，戴洪義

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，山東青島，266109)

大孔樹脂提純蘋果類黃酮的研究*

王英，張玉剛，戴洪義

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，山東青島，266109)

研究大孔樹脂分離純化蘋果類黃酮工藝。采用AB-8，DM-130，NAK-9三種大孔樹脂對蘋果類黃酮進行吸附解析，以類黃酮吸附和解析率為指標(biāo)綜合評價，優(yōu)選出最佳樹脂;對優(yōu)選出的樹脂進行吸附和解析條件探討。結(jié)果表明:3種大孔樹脂吸附率分別為70.55%，62.45%，74.13%，解析率分別為92.66%，86.84%，87.22%。AB-8樹脂綜合性能較好。優(yōu)化AB-8樹脂吸附工藝參數(shù)為:吸附液濃度0.64mg/mL吸附液pH值6.0，吸附流速1mL/min。解析工藝參數(shù)為:解析乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，解析流1.6mL/min。蘋果類黃酮回收率及純度分別可達89.46%，為92.50%。

蘋果，類黃酮，大孔樹脂，純化

蘋果類黃酮粗提物中含有大量的多糖，有機酸等多種雜質(zhì)，需進一步分離純化。大孔樹脂具有吸附量大、易洗脫、選擇性好、強度大、可重復(fù)使用等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于天然植物有效成分的提取和純化［1－4］。田景振等［5］研究了大孔樹脂分離純化淫羊藿總黃酮的方法，經(jīng)DM－130型大孔吸附樹脂吸附處理后總黃酮純度較高。韓博等［6］的研究表明，AB-8對甘草類黃酮有較好的吸附和解析性能;王育紅等［7］研究表明，NAK-9對蘋果多酚的動態(tài)吸附工藝。本文對AB-8，DM-130，NAK-9三種大孔樹脂對蘋果類黃酮的吸附和解析性能進行了篩選，并對AB-8吸附解析條件進行了研究，以期為蘋果類黃酮的開發(fā)利用提高參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的蘋果雜種品系95-32(特拉蒙×嘎啦)的果實;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為分析純;樹脂(凈品型):AB-8，DM-130，NAK-9(天津市海光化工有限公司)。

冷凍干燥機;HR2006飛利浦?jǐn)嚢铏C;KQ-300型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司);SBH-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵;Ultrospec 3300 pro紫外-可見光分光光度計。SBS-100數(shù)控計滴部分收集器;HL－2S橫流泵;15 mm×250 mm層析柱。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試液的制備

蘋果果皮→冷凍干燥→粉碎→過篩→超聲提取→抽濾→減壓濃縮→供試液

1.2.2 黃酮測定方法

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法［8］。

1.2.3 大孔樹脂吸附及解析性能的測定

(1)樹脂預(yù)處理:3種大孔樹脂分別用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，然后用乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗至無乙醇，吸干樹脂中水分。

(2)樹脂吸附率和解析率的測定:準(zhǔn)確稱量2 g預(yù)處理的樹脂，置于100mL容量瓶中，加入50mL一定濃度的供試液，振蕩吸附24 h(25℃、150 r/min)，測定類黃酮溶液的濃度，計算吸附量。用去離子水洗去殘留黃酮后吸干水分，然后加入50mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，振蕩解析24 h，測定解析液中類黃酮濃度，計算解析量。

式中:B0，供試液濃度;B1，吸附平衡后類黃酮濃度(mg/mL);B2，解析液濃度(mg/mL);Q1，吸附率(%);Q2，解析率(%)。

1.2.4 大孔樹脂AB-8，NAK-9靜態(tài)吸附及解析動力學(xué)曲線測定解hkjk析率

準(zhǔn)確稱量樹脂AB-8，NAK-9各2 g，分別放入100mL三角瓶中，加入一定濃度的供試液，振蕩5 h內(nèi)，每隔0.5 h測定一次類黃酮溶液的濃度，繪制靜態(tài)吸附曲線。

準(zhǔn)確稱量吸附飽和的樹脂AB-8，NAK-9各2 g，分別放入100mL三角瓶中，加入濃度80%酒精進行解析，振蕩5 h內(nèi)，每隔0.5 h測定一次類黃酮溶液的濃度，繪制靜態(tài)解析曲線。

1.2.5 類黃酮濃度對樹脂AB-8吸附效果的影響

稱取6份預(yù)處理樹脂2 g，分別加入不同濃度提取液，振蕩24 h測定溶液中剩余類黃酮的濃度。確定最佳吸附濃度。

1.2.6 乙醇濃度對樹脂AB-8解析效果的影響

準(zhǔn)確稱量10份飽和吸附類黃酮的AB-8樹脂各2 g，分別加入濃度為不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，振蕩解析24 h，測定解析液中類黃酮濃度及解析液中可溶性固形物含量。

1.2.7 吸附液pH值對AB-8吸附效果的影響

取預(yù)處理的AB-8樹脂各2 g，分別加入不同pH值吸附液30mL，振蕩24 h測定溶液中剩余類黃酮的濃度。將不同pH值吸附的樹脂用去離子水沖洗掉殘留類黃酮并將水吸干，加入70%乙醇30mL振蕩24 h，根據(jù)吸附量和解析量確定最佳吸附pH值。

1.2.8 AB-8樹脂對蘋果類黃酮的動態(tài)吸附試驗

根據(jù)靜態(tài)吸附條件，對其動態(tài)泄露曲線與動態(tài)解析曲線進行考察。將處理好的樹脂濕法裝入玻璃層析柱中(10 mm×200 mm)，將蘋果類黃酮以不同流速上樣。將上柱并充分吸附的樹脂，以70%乙醇在不同流速下進行解析。每5 min收集一次流出液并測定有效成分的濃度。

1.2.9 蘋果類黃酮純度的測定

分別將粗提液及經(jīng)AB-8在吸附液濃度0.64mg/mL，吸附液pH值6.0，吸附流速1mL/min，解析乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，解析流1.6mL/min條件下純化的類黃酮解析液進行減壓濃縮，冷凍干燥。稱取一定干燥物用60%乙醇溶解配成溶液按1.2.2中方法測定溶液中有效成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹脂對蘋果類黃酮吸附率和解析性能的測定

由表1可知，極性樹脂NAK-9對蘋果類黃酮的吸附率較高，弱極性的樹脂AB-8次之，弱極性的樹脂DM-130對類黃酮的吸附率最低。而弱極性樹脂AB-8解析率較高，極性樹脂NAK-9對類黃酮解析率較AB-8低，樹脂AB-8和NAK-9對類黃酮的解析量差異不明顯。弱極性樹脂DM-130無論從吸附率還是解析率都沒有明顯優(yōu)勢。因此，選取 AB-8和NAK-9進行近一步靜態(tài)吸附和解析試驗。

表1 3種大孔樹脂對蘋果類黃酮的吸附和解析性能

2.2 大孔樹脂AB-8，NAK-9靜態(tài)吸附及解析

由圖1(a)可知，大孔樹脂AB-8和NAK-9相比較，NAK-9吸附量較高，但由圖1(b)解析量來分析，在解析1 h內(nèi)NAK-9解析量大于AB-8，解析1 h后AB-8解析量大于NAK-9的，NAK-9解析速率小于AB-8，且解析量小于AB-8。因此，選擇AB-8對蘋果類黃酮進一步進行吸附和解析實驗。

為了定量衡量AB-8和NAK-9樹脂對蘋果類黃酮的吸附速度，用Langmuir單層吸附模型擬合計算AB-8、NAK-9樹脂的平衡速率常數(shù)。根據(jù) Langmuir［9－10］提出的平衡吸附速率方程:LnQe/(Qe-Qt)=k×t即:-Ln(1－Qt/Qe)=k×t

其中:Qt，t時刻樹脂吸附量;Qe，吸附平衡時樹脂的吸附量;k:吸附速率常數(shù)。

以-ln(1－Qt/Qe)對時間作圖得一直線，由斜率可求得樹脂蘋果類黃酮吸附的平衡速率常數(shù)k。

擬合決定系數(shù) R2分別為0.973、0.975 5，說明AB-8、NAK-9樹脂與Langmuir單層吸附模型擬合較好。平衡常數(shù)k是反映樹脂靜態(tài)吸附的重要參數(shù)，吸附速率常數(shù)k越小，說明到達平衡所需時間較長。NAK-9的k值小于AB-8的k值，因此NAK-9的吸附速率小于AB-8。

2.3 蘋果類黃酮濃度對AB-8樹脂吸附的影響

由圖3可知，蘋果類黃酮濃度是影響樹脂吸附性能的重要因素之一。上樣濃度低于0.64mg/mL時，隨著濃度的增大，AB-8對蘋果類黃酮的吸附量逐漸增大。當(dāng)類黃酮濃度高于0.64mg/mL時，隨著濃度的增大，提取液中與類黃酮競爭吸附雜質(zhì)量也隨之增加，使蘋果類黃酮在樹脂內(nèi)部擴散能力下降，從而導(dǎo)致樹脂吸附量有所下降。

圖1 2種樹脂靜態(tài)吸附及解析動力學(xué)曲線

圖2 樹脂對蘋果類黃酮的吸附平衡方程

圖3 類黃酮濃度對樹脂AB-8吸附效果的影響

2.4 乙醇濃度對AB-8解析量的影響

由圖4可知，當(dāng)解析液乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，類黃酮的解析量最大。乙醇濃度過小，則使解吸劑極性偏大;反之，解吸劑濃度過大，則使得解吸劑極性偏小。由此可見，在進行解吸操作時，解吸劑的濃度不宜過大或者過小，只有當(dāng)極性合適的情況下才可以達到最佳的效果。

圖4 不同濃度乙醇對類黃酮解析效果的影響

2.5 吸附液pH值對AB-8吸附效果的影響

由圖5可知，pH值為4、6、10時，樹脂對蘋果類黃酮的吸附量較大，通過對吸附不同pH吸附液的樹脂進行解析發(fā)現(xiàn)，吸附液pH值為6時解析量最大。這是由于在pH值為4和10時類黃酮不穩(wěn)定，是在吸附過程中類黃酮損失造成。因此，pH值為6是最佳吸附條件。

圖5 吸附液不同pH對吸附效果的影響

2.6 樹脂AB-8吸附流速的選擇

通過調(diào)節(jié)橫流泵調(diào)節(jié)上樣液的流速，應(yīng)以泄漏點最遲出現(xiàn)的吸附流速為宜。當(dāng)流出液濃度達1/10上樣液濃度時視為泄漏點。由圖6可知，流速為2.2mL/min時，泄漏點出現(xiàn)最早，在15 min即上液量為33mL;流速為1mL/min時泄漏點最晚出現(xiàn)，在75 min即上液量為75mL;流速為1.6mL/min時泄漏點出現(xiàn)，在35 min即上液量為56mL。吸附流速增大時，泄漏率成增大趨勢，這是因為流速過快時，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂表面就會漏過，因此慢速有利于吸附。

圖6 不同進樣速度對樹脂AB-8吸附性能的影響

2.7 不同吸附流速滲漏曲線考察

按上述操作，變換，以ln(u-y)對流出體積x作圖(u即upper bound，應(yīng)略大于最大值)，求得一元線性回歸方程。1mL/min時所得方程為:y=－0.017 4x－2.060 4，R2=0.952 1;1.6mL/min時方程為:y=－0.024 3x－1.906 8，R2=0.960 1;2.2mL/min時，所得方程為:y=－0.035 5x－1.684 7，R2=0.9714。直線斜率以－k表示。經(jīng)轉(zhuǎn)化整理后，累積滲出濃度與流出液體積關(guān)系符合以下單指數(shù)方程:y=u(1－e－kx)

圖7 不同流速速度擬合線性圖

2.8 樹脂AB-8解析流速的選擇

洗脫速率分別為1、1.6、2.2mL/min時，AB-8型大孔樹脂對蘋果總黃酮的洗脫率分別為83.2%、89.46%、91.5%。可以看出，洗脫速度為1mL/min時，解析較慢，使得樹脂顆粒將被解析的分子物質(zhì)又從溶劑中吸附過來，生產(chǎn)周期長，且解析率低。洗脫速度為2.2mL時洗脫率高，且洗脫速率高，但乙醇浪費嚴(yán)重。因此選用1.6mL/min進行洗脫。

粗提物中含較高的糖分和其他雜質(zhì)，其純度為3.60%，經(jīng)純化后純度可達92.50%。進行純化后，蘋果類黃酮的純度大大提高。

圖8 不同洗脫速度下類黃酮的洗脫效果曲線

3 結(jié)論

(1)通過對樹脂AB-8，DM-130，NAK-9三種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解析能力測定，結(jié)果表明AB-8，DM-130，NAK-9吸附率分別為 70.55%，62.45%，74.13%，解析率分別為92.66%，86.84%，87.22%.極性樹脂NAK-9吸附率較弱極性樹脂AB-8吸附率大，DM-130吸附率最低;但AB-8解析率明顯高于NAK-9和DM-130，AB-8純化類黃酮回收量高于其他2種樹脂。AB-8較適合蘋果中類黃酮成分的純化。

(2)AB-8對蘋果類黃酮的最佳吸附條件為:上柱液濃度0.64mg/mL上柱液 pH值6.0，上柱流速1mL/min，解析乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，解析速率1.6mL/min。

(3)蘋果類黃酮經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，純度由3.6%提高至92.5%，回收率為89.46%。

(4)AB-8、NAK-9樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線與Langmuir單層吸附模型擬合較好。滲漏曲線中，累積滲出濃度與流出液體積關(guān)系符合單指數(shù)方程:y=u(1－e－kx)。

［1］Aiken G R，McKnight D M，Thorn K A，et al.Isolation of hydrophilic organic acids from water using nonionic macroporous resins［J］.Organnic Geochemistry，1992，18(4):467－573.

［2］何炳林，史作清.大孔離子交換樹脂及新型吸附樹脂的結(jié)構(gòu)與性能［J］.高分子通報，2005(4):13－19.

［3］Silva E M，Pompeu D R，Larondelle Y，et al.Optimisation of the adsorption of polyphenols from Inga edulis leaves on macroporous resins using an experimental design methodology［J］.Separation and Purification Techn－ology.2007，53(3):274－280.

［4］Fu Yujie，Zu Yuangang，Liu Wei.Optimization of luteolin separation from pigeonpea［Cajanus cajan(L.)Millsp.］leaves by macroporous resins［J］.Journal of Chromatography A，2006，1 137(2):145－152.

［5］葛淑蘭，田景振.大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮的分離純化工藝研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2005，40(5):365－367.

［6］韓博，陳文，景文娟，等.AB－8大孔吸附樹脂對甘草總黃酮的吸附［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，27(3):265－267.

［7］王育紅，朱維軍，潘治利，等.NKA 9大孔樹脂對蘋果多酚的動態(tài)吸附工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2009，40(8):119－123.

［8］陳陽，王軍華，陳亞光，等.紅花蕓豆色素的提取及穩(wěn)定性研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(6):175－179.

Purification of Flavonoid from Apple with Macroporous Resin

Wang Ying，Zhang Yu-gang，Dai Hong-yi
(College of Landscaping and Horticulture，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

To establish a technical procedure for the purification of flavonoids from apple.Three types of macro porous resin(AB-8，DM-130，and NAK-9)were used to absorb and desorb apple flavonoid.The rate of absorption and desorption were compared among the resins.The conditions of absorbability and desorption were further investigated.The absorbability rate of three types of macro porous resin were 70.55%，62.45%，74.13%respectively，The desorption rate were 92.66%，86.84%.87.22%respectively.The results indicated that AB-8 macroporous resin was the best.The optimum adsorption conditions were as follows:sample concentration 64mg/mL，pH6.0 and the feeding rate 1mL/min.The optimum desorption parameters were as follows:ethanol concentration 70%，the flow rate.1.6mL/min.The reclaimed ratio was 89.46% and the purity of the flavonoids extracted from apple fruit was 92.5%.

apple，flavonoid，macroporous resin，purification

碩士研究生(戴洪義為通訊作者)。

*國家“十一五”科技支撐計劃項目(2008BAD92B01);國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(XDNYCYTX);山東良種產(chǎn)業(yè)化工程項目

2010－08－05，改回日期:2010－09－15