張一平，華洵璐，孫梅，謝駿，匡群，何義進(jìn)

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214081)2(江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫，214063)

雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法測(cè)定酵母核酸水解的4種核苷酸*

張一平1，2，華洵璐1，2，孫梅1，2，謝駿1，匡群1，2，何義進(jìn)1

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214081)2(江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫，214063)

建立了酵母核酸水解率簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、低成本測(cè)定方法。采用雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法同時(shí)測(cè)定酵母核酸水解的4種單體核苷酸;采用變異系數(shù)(CV)和平均回收率分析該測(cè)定方法的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，10%醋酸電泳結(jié)合飽和硫酸銨∶1mol/L醋酸銨∶異丙醇(體積比，80∶18∶2)的展層劑，能同時(shí)分離4種核苷酸;測(cè)定相關(guān)系數(shù)R均大于0.985;測(cè)定核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液的變異系數(shù)分別為AMP 1.30%、GMP 1.44%、CMP 1.36%、UMP 1.31%;測(cè)定酵母RNA水解液對(duì)應(yīng)的變異系數(shù)分別為2.45%、2.01%、2.75%、2.06%;回收率在94.80%～106.57%，最低檢出限在0.65～0.72mg/mL。

核酸，核苷酸，紙層析，紙電泳

核酸RNA是重要的生物大分子，在生物體的遺傳變異、生長發(fā)育以及蛋白質(zhì)合成中起著重要作用［1］。核酸用5’-磷酸二酯酶催化水解，控制反應(yīng)條件，可獲得腺苷酸(AMP)、鳥苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)4種小分子的單體核苷酸［2］。核苷酸是一類具有重要生理功能的物質(zhì)［3］，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè)［4］，農(nóng)業(yè)上可作為植物生長促進(jìn)劑［5］，飼料上可用作安全高效的添加劑［6］，尤其對(duì)于能耐受較高劑量核苷酸的水生動(dòng)物效果更明顯［7－8］。

啤酒廢酵母是啤酒工業(yè)主要副產(chǎn)物，其中RNA含量為6%～8%，是生產(chǎn)核苷酸產(chǎn)品的絕好原料［9］。近年來綜合利用啤酒廢酵母提取核苷酸的研究越來越多，促進(jìn)了對(duì)核酸水解產(chǎn)物核苷酸分析方法的研究。

目前國內(nèi)外測(cè)定核苷酸的方法，主要分為反相高效液相色譜法［10－11］、高效毛細(xì)管電泳法［12－13］和離子交換液相色譜法［14－15］。反相高效液相色譜法具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但分離的核苷酸種類有限，如果要分離核苷酸種類較多的樣品，必須采用繁瑣的梯度洗脫法，因此該方法具有一定的局限性。高效毛細(xì)管電泳法具有很高的分離效率，能將各種核苷酸很好地分離，具有快速、污染小的特點(diǎn)，但目前所用儀器主要靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，使用受到一定條件的限制。離子交換色譜法具有較高的分離效率，尤其對(duì)于核苷酸、氨基酸這些生物體中的兼性離子化合物，能很好地將其分離，但需要對(duì)分離柱進(jìn)行平衡(再生)，分析時(shí)間比較長，主要用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品等的分析［16］。

以上方法的共同缺陷是操作復(fù)雜、測(cè)定成本高。本論文根據(jù)酵母RNA降解產(chǎn)物的復(fù)雜程度，針對(duì)核苷酸的帶電量以及分子量差異的特點(diǎn)，對(duì)分離4種核苷酸的電泳系統(tǒng)和層析溶劑進(jìn)行篩選試驗(yàn)，采用紙電泳—紙層析結(jié)合法同時(shí)分離測(cè)定4種核苷酸。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

麥芽根:購自中糧麥芽(江陰)有限公司。酵母RNA:用啤酒廢酵母自制，RNA純度90%。蒸餾水:購自無錫華晶飄之霖有限公司。

1.1.2 主要試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、異戊醇、異丁醇、異丙醇、吡啶、95% 乙醇、硼砂、硼酸、NaCo3、NaHCo3、醋酸鈉、醋酸銨、HCl、(NH4)2SO4、ZnSO4、MgSO4:均為分析純，國藥上?；瘜W(xué)試劑公司。AMP、GMP、UMP、CMP標(biāo)準(zhǔn)品:均為生化試劑級(jí)，購自Sigma公司。

濾紙:采用國產(chǎn)新華1號(hào)，長30cm，寬15cm。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

AE-100電子分析天平(0.000 1 g)、DYY-6C型電泳儀、TDL-40B臺(tái)式低速離心機(jī)、751紫外分光光度計(jì)、紫外顯色儀、層析缸。

1.2 方法

1.2.1 紙電泳緩沖液

緩沖液Ⅰ:10%醋酸;緩沖液Ⅱ:0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5);緩沖液Ⅲ:0.2mol/L乙酸-乙酸鈉(pH值5.0);緩沖液Ⅳ:0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉(pH值10.8)緩沖液Ⅴ:0.2mol/L硼酸-硼砂(pH值9.0)

1.2.2 紙層析溶劑系統(tǒng)

溶劑系統(tǒng)Ⅰ:V(異戊醇)∶V(5%檸檬酸鈉)=1∶1;溶劑系統(tǒng)Ⅱ:V(異丁醇)∶V(吡啶)∶V(醋酸)∶V(水)=12∶6∶1∶4;溶劑系統(tǒng)Ⅲ:V(95% 乙醇)∶V(醋酸鈉)=7∶3(用醋酸調(diào)pH 5.0)溶劑系統(tǒng)Ⅳ:V(異丁醇)∶V(15N 硫酸銨)∶V(0.1mol/L 硼酸)=6∶1∶3;溶劑系統(tǒng)Ⅴ:V(飽和硫酸銨)∶V(1mol/L醋酸銨)∶V(異丙醇)=80∶18∶2。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法

精確稱取UMP標(biāo)準(zhǔn)品1 g，溶解于50mL蒸餾水中;分別吸取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL 于 10mL容量瓶中，定容，對(duì)應(yīng)的濃度分別為 6、8、10、12、14mg/mL。各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別走紙電泳(點(diǎn)樣量5μL，電泳2 h，電壓500 V)。電泳結(jié)束后，晾干;逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°后，放于層析缸中走紙層析8 h。

將層析紙晾干或烘干后，紫外儀(波長2537A)下觀看層析斑。將斑點(diǎn)剪下，用5mL的0.1mol/L HCl浸提3 h(每隔15 min振搖1次);4 000 r/min離心10 min，取上清液紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫外吸收值，0.1mol/L HCl為參比對(duì)照。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制UMP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

AMP、GMP、CMP標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與UMP相同，只是改用蒸餾水作為浸提液。

1.2.4 核苷酸混合液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品混合液:精確稱取 AMP、GMP、UMP、CMP標(biāo)準(zhǔn)品各2.5 g，一起溶解于100mL蒸餾水中，每種核苷酸的濃度均為25mg/mL。

已知濃度的核苷酸混合液:從酵母RNA酶解、純化制得，含 AMP 8.72mg/mL、GMP 9.67mg/mL、UMP 6.80mg/mL、CMP 8.10mg/mL。

1.2.5 酵母核酸RNA水解樣的制備

將新鮮、干燥的麥芽根30 g，粉碎，過80目篩;加入300mL水，攪拌;置4℃冰箱浸泡18 h;4層紗布過濾，濾液4 000 r/min離心5 min;上清液70℃水浴5 min滅雜酶后，即為5’-磷酸二酯酶粗酶液。稱取80 g酵母RNA，溶解于1 200mL水中;2mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH7.0，加入 0.2mol/L 的 MgSO4、10－3mol/L 的ZnSO4，然后倒入粗酶液;70℃水浴攪拌反應(yīng)2 h;升溫至90℃滅酶5 min。測(cè)定水解液中4種核苷酸的含量。

1.2.6 測(cè)定誤差分析方法

精密度的高低用變異系數(shù)(CV)表示、準(zhǔn)確度用平均加標(biāo)回收率表示;包括標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)、最低檢出限(DL)等的計(jì)算公式參見文獻(xiàn)［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種單體核苷酸在不同紙電泳系統(tǒng)中的遷移效果

將濃度為10mg/mL的核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別點(diǎn)樣至不同緩沖液中，電泳2 h，電壓500 V，結(jié)果見表1。

表1 四種核苷酸在不同電泳緩沖液中的遷移距離

由表1可知，只有10%的醋酸和乙酸-乙酸鈉緩沖液能將GMP和UMP單獨(dú)地分離出來;而其他3種緩沖液只能分離出1種核苷酸?？紤]到配制溶液的方便性，選擇10%醋酸作為電泳緩沖液。

2.2 4種單體核苷酸在雙向紙電泳-紙層極系統(tǒng)中的分離效果

由于AMP和CMP在10%醋酸電泳液中遷移距離相近，不能單獨(dú)分開，所以必須尋找一種能將兩者分開的溶劑系統(tǒng)。本論文將濃度為10mg/mL的核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別先在10%醋酸電泳液中走紙電泳，然后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，再在不同的溶劑系統(tǒng)中走紙層析(層析8 h)，結(jié)果見表2。

表2 四種核苷酸先10%醋酸紙電泳-再紙層析的Rf值

由表2可知，溶劑系統(tǒng)(V)其AMP與CMP的Rf值相差最大，所以選擇該溶劑作為電泳后的紙層析溶劑系統(tǒng)。

2.3 雙向紙電泳-紙層析系統(tǒng)對(duì)四種核苷酸混合液的分離效果影響

以上實(shí)驗(yàn)均是將單獨(dú)的核苷酸點(diǎn)樣后的結(jié)果，為了更進(jìn)一步確定該紙電泳-紙層析系統(tǒng)同時(shí)分離4種核苷酸的效果，取濃度各為25mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，先走紙電泳，然后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，再走紙層析，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 四種核苷酸混合液在10%醋酸電泳液中的電泳結(jié)果

圖2 四種核苷酸混合液在溶劑系統(tǒng)(V)中的層析結(jié)果

從圖1可知，4種核苷酸的混合液，經(jīng)10%醋酸電泳后，能清楚地分離出 GMP和 UMP，最上面是UMP斑點(diǎn)、中間是GMP斑點(diǎn)，而最下面的是AMP和CMP的混合點(diǎn)。

從圖2可知，4種核苷酸的混合液先走紙電泳，再走紙層析，能將AMP和CMP有效地分開，CMP的位置在AMP的正上方，且距離相差很大。

2.4 雙向紙電泳—紙層析結(jié)合法測(cè)定4種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

先以10%醋酸電泳系統(tǒng)，再以V(飽和硫酸銨)∶V(1M 醋酸銨)∶V(異丙醇)=80∶18∶2 為紙層析溶劑系統(tǒng)，按照1.2.3小節(jié)的描述，分別建立4種核苷酸的測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3－圖6。

圖3 AMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 GMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 UMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 CMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

由上圖3～圖6可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，紫外吸收值(OD值)與濃度呈良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R均在0.985以上，表明OD值與濃度之間有較精確的相互關(guān)系。由此得出“雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”測(cè)定核苷酸的計(jì)算公式為:

AMP含量(mg/mL)=1/0.034×OD259×稀釋倍數(shù)=29.41×OD259×稀釋倍數(shù)

GMP含量(mg/mL)=1/0.017×OD262.5×稀釋倍數(shù)=58.82×OD262.5×稀釋倍數(shù)

CMP含量(mg/mL)=1/0.016×OD260×稀釋倍數(shù)=62.50×OD260×稀釋倍數(shù)

UMP含量(mg/mL)=1/0.020×OD262×稀釋倍數(shù)=50.00×OD262×稀釋倍數(shù)

2.5 “雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”的精密度測(cè)定

按照1.2.4小節(jié)的描述，配制核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液1份(每種核苷酸的濃度均為25mg/mL)，在同一天連續(xù)進(jìn)行5次測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 “雙向紙電泳—紙層析結(jié)合法”的精密度結(jié)果

從表3可知，4種核苷酸的變異系數(shù)CV均≤2.0%，表明該方法測(cè)定的精密度結(jié)果符合分析要求。以2倍信噪比計(jì)算的 AMP、GMP、CMP、UMP的最低檢出限分別為 0.65、0.72、0.68、0.65mg/mL。

2.6 “雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”的準(zhǔn)確度測(cè)定

取已知濃度的核苷酸混合液1份，加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，制備成高(約20mg/mL)、中(約15mg/mL)、低(約10mg/mL)3個(gè)濃度的混合液，測(cè)定3次求平均值，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表4。

表4 “雙向紙電泳—紙層析結(jié)合法”的回收率測(cè)定結(jié)果

由表4可知，AMP的回收率在 95.20%～98.62%、GMP的回收率在 101.46%～106.57%、CMP的的回收率在94.80%～96.92%、UMP的回收率在98.43%～100.40%，回收率達(dá)到理想效果，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，完全可以用于核酸水解率的測(cè)定。

2.7 “雙向紙電泳-紙層析結(jié)合法”測(cè)定酵母核酸RNA水解樣中四種核苷酸的含量

按照1.2.5小節(jié)的描述，制備酵母核酸RNA酶水解液共5個(gè)批次，測(cè)定樣液中的核苷酸含量，結(jié)果見表5。

表5 磷酸二酯酶水解酵母核酸RNA樣液中四種核苷酸的測(cè)定結(jié)果

從表5可知，5個(gè)批次酵母核酸RNA水解樣的測(cè)定結(jié)果表明，4種核苷酸的變異系數(shù)在2.01%～2.75%，數(shù)據(jù)的重復(fù)性仍舊較好，其精密度仍在儀器分析要求之內(nèi)，可以滿足酵母核酸水解率測(cè)定的需要。

3 討論

盡管我國的國家標(biāo)準(zhǔn)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有肌苷酸和鳥苷酸的檢測(cè)方法［18～19］，但由于酵母核酸RNA水解產(chǎn)物的復(fù)雜性，4種單體核苷酸混合在一起，且僅是產(chǎn)物的一部分，因此無法直接引用這些標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。目前采用的高效液相色譜等方法，需要通過梯度洗脫分離出純核苷酸才能檢測(cè)，操作非常復(fù)雜，且儀器設(shè)備要求高，測(cè)定成本高。而如果單純采用紙電泳法或紙層析法，卻無法找到一種溶劑系統(tǒng)能同時(shí)分離這4種核苷酸。

本論文針對(duì)上述難題，首先對(duì)核苷酸的紙電泳系統(tǒng)和紙層析展開劑進(jìn)行了大量篩選實(shí)驗(yàn)，最終尋找到了一種紙電泳和紙層析結(jié)合系統(tǒng)能將四種核苷酸完全地分開，從而建立了一種新的酵母核酸水解產(chǎn)物測(cè)定方法。對(duì)于核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液以及酵母核酸RNA水解液，該測(cè)定方法5次重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)分別在1.30%～1.44%和2.01%～2.75%，最低檢出限 0.65～0.72mg/mL，準(zhǔn)確度 94.80% ～106.57%，表明其精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果與高效液色譜等方法相近［10－16］。

本論文建立的測(cè)定方法最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、儀器要求不高、測(cè)定成本低，可一次性同時(shí)測(cè)定出4種核苷酸的含量。

在采用酵母細(xì)胞生產(chǎn)核苷酸的工藝過程中，急需建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、廉價(jià)的分析定量方法進(jìn)行生產(chǎn)過程監(jiān)控和產(chǎn)品質(zhì)量控制，本論文建立的測(cè)定方法具有實(shí)際應(yīng)用意義。對(duì)于保健品、食品、食用菌等產(chǎn)品中的核苷酸檢測(cè)，該方法也具有一定的推廣價(jià)值。

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Determination of Four Nucleotides from Yeast RNA Hydrolysate Combined the Methods of Paper Electrophoresis and Paper Chromatography

Zhang Yi-ping1，2，Hua Xun-lu1，2，Sun Mei1，2，Xie Jun1，Kuang Qun1，2，He Yi-jin1
1(Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes，Ministry of Agriculture，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Science，Wuxi 214081，China)2(Jiangsu limited company of Suwei microbiology，Wuxi 214063，China)

To establish the simple，accurate and inexpensive determination method of yeast RNA hydrolyzed yield.Method:The four single nucleotides of RNA hydrolysate were determined by the combined methods of paper electrophoresis and paper chromatography;the precision and accuracy of this method were analyzed using coefficient of cariation(CV)and average recovery .Result:Combined the 10%acetic acid buffer and the saturated(NH4)2SO4∶1M ammonium acetate∶isopropanol(80∶18∶2，V/V);developing solvent，the four single nucleotides could be separated simultaneously;the relative coefficient(R)were all more than 0.985;the CV value of AMP，GMP，CMP，UMP was 1.30%，1.44%，1.36%and 1.30%respectively in the standard nucleotides mixture sample，while the CV value was 2.45%，2.01%，2.75%and 2.06%respectively in the yeast RNA hydrolization liquid;the average ratio of recovery were between 94.80%and 106.57%;the minimum detection limit were between 0.65～0.72mg/mL.Conclusion:The determination method deployed in this paper had the advantages of meticulous precision，high degree of accuracy，lower investment of instrument and cheaper cost，so it can be promoted widely.

nucleic acid，nucleotides，paper electrophoresis，paper chromatography

學(xué)士，副研究員。

*農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目:新型安全高效水產(chǎn)飼料添加劑——酵母核苷酸的研究開發(fā)(BZ2009);2008農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目:生態(tài)高效規(guī)范化淡水養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)示范(2008GB2C100110)。

2010－04－27