聶蕓，周倩，屈曉清，李晉麗，丁之恩

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥，230036)

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化茶皂素的提取工藝*

聶蕓，周倩，屈曉清，李晉麗，丁之恩

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥，230036)

以油茶餅為原料，甲醇為提取劑，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素基礎(chǔ)上，選定料液比、提取溫度和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以茶皂素提取效率為目標(biāo)建立回歸數(shù)學(xué)模型，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化得到茶皂素的優(yōu)化提取條件。試驗(yàn)結(jié)果表明:料液比1∶9(g∶mL)、超聲溫度50℃、超聲提取時(shí)間57 min為超聲波輔助提取茶皂素的最佳工藝條件，此條件下茶皂素提取效率可達(dá)到80.89%。

茶皂素，二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，超聲輔助提取

茶皂素(tea saponin)，又稱(chēng)茶皂苷、茶皂苷、皂角苷，是一種五環(huán)三萜類(lèi)皂苷化合物，大量存在于油茶餅中。茶皂素是一種天然非離子型表面活性劑［1］，在分散、濕潤(rùn)、發(fā)泡、去污等方面具有良好的活性［2－3］，并具有抗炎、抗?jié)B透、祛痰、止咳、鎮(zhèn)痛、殺菌、殺蟲(chóng)及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種生理功效［4－5］，因此在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［6～10］。

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)是正交回歸組合設(shè)計(jì)的一種，具有旋轉(zhuǎn)性，能夠克服回歸正交設(shè)計(jì)中二次回歸預(yù)測(cè)值的方差依賴于試驗(yàn)點(diǎn)在因子空間中位置的缺點(diǎn)，有利于得到較優(yōu)的提取工藝條件［11－12］。

茶皂素的傳統(tǒng)提取方法主要是浸提法，如水提法，有機(jī)溶劑浸提法［13－14］。隨著工藝的改進(jìn)，又有了超聲波輔助提取法［15－16］，微波輔助提取法［17－18］等。由于茶皂素易溶于甲醇，而甲醇沸點(diǎn)較低，且易回收，因此本文采用甲醇作為提取劑，利用超聲波輔助提取，并結(jié)合二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，建立了以茶皂素提取效率為目標(biāo)函數(shù)的數(shù)學(xué)模型，并研究了料液比、提取時(shí)間和提取溫度之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅:經(jīng)野生油茶籽壓榨油后得到，由安徽舒城縣夏凡茶油廠提供;石油醚、甲醇、正丁醇、香草醛、濃硫酸、無(wú)水乙醇:均為分析純;茶皂素對(duì)照品:天津一方科技有限公司。

1.2 主要儀器

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司;HITACHI SCT 15B型離心機(jī)，日本日立公司;真空干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;DFT-100多功能中藥粉碎機(jī)，溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司;FA2104萬(wàn)分之一電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;KQ3200DE型數(shù)控超聲波提取器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

原料經(jīng)干燥粉碎后，用石油醚加熱回流，過(guò)濾后揮干濾渣中的石油醚，得到脫脂的油茶餅粕。

1.3.2 茶皂素樣液的制備

精確稱(chēng)取脫脂茶餅粉若干份，每份5.000 0 g，加入一定體積甲醇按不同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件進(jìn)行超聲波輔助提取，揮干溶劑后加水溶解，用水飽和的正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮至干，用甲醇定容到50mL容量瓶，待測(cè)。

1.3.3 紫外分光光度法測(cè)定茶皂素含量［19］

用甲醇將茶皂素對(duì)照品制備成1mg/mL對(duì)照品溶液，分別取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，置于具塞試管中，并加甲醇至溶液體積為0.5mL，準(zhǔn)確加入80g/L香草醛溶液0.5mL，于冰水浴中加入77%硫酸溶液4mL，搖勻，于60℃加熱15 min，取出，冰水浴冷卻。以試劑為空白，于波長(zhǎng)為550 nm下測(cè)定吸光值，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)、茶皂素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為:Y=1.089 5X－0.123 5，R2=0.996 3。

1.3.4 原料茶餅中茶皂素的測(cè)定

精確稱(chēng)取2.500 0 g的脫脂茶餅粉末，濾紙包好置于索氏抽提器中，用甲醇回流提取3 h，直至回流液呈無(wú)色，提取液經(jīng)濃縮、水飽和正丁醇萃取后，用甲醇定容，按1.3.3中方法測(cè)定原料茶餅中茶皂素含量。

1.3.5 超聲波輔助提取法的單因素和二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

以甲醇為提取劑，采用超聲波輔助提取，對(duì)料液比、超聲作用時(shí)間和提取溫度等因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平的二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，以茶皂素提取效率為考核指標(biāo)，確定最優(yōu)提取方案和工藝參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

二次通用旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果分析均在DPS數(shù)據(jù)處理軟件上運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)茶皂素提取效率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份5.000 0 g油茶餅粕，分別按料液比(g∶mL)1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 于 40℃超聲提取30 min，料液比對(duì)茶皂素提取效率的影響如圖1。

圖1 料液比對(duì)茶皂素提取效率的影響

從圖1中可以看出，隨著浸提液料比的增加，茶皂素提取效率增加，在料液比達(dá)到1∶8左右時(shí)，再增加料液比提取效率基本不變。因此，選用1∶8的料液較為合適。

2.2 提取時(shí)間對(duì)茶皂素提取效率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份5.000 0 g油茶餅粕，料液比為1∶8，分別于 40℃超聲提取 30、40、50、60、70 min，浸提時(shí)間對(duì)茶皂素提取效率的影響結(jié)果如圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響

從圖2可以看出，超聲時(shí)間愈長(zhǎng)，茶皂素提取效率愈高，在超聲50 min左右時(shí)，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，茶皂素提取效率增長(zhǎng)趨緩，因此選取超聲時(shí)間50 min為宜。

2.3 提取溫度對(duì)茶皂素提取效率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取五份5.000 0 g油茶餅粕，料液比為1∶8，分別于 30、40、50、60、70℃ 的條件下超聲提取 50 min，浸提溫度對(duì)茶皂素提取效率的影響如圖3。

圖3 溫度對(duì)茶皂素提取效率的影響

從圖3可看出，隨著溫度的升高，茶皂素的提取效率也隨之提高，但到70℃時(shí)提取效率降低，主要原因是此時(shí)溫度已超過(guò)甲醇沸點(diǎn)，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，因此選擇50℃左右為宜。

2.4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)茶皂素提取影響較大的料液比(X1)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)為3個(gè)試驗(yàn)因素，以茶皂素提取效率為目標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用以優(yōu)化茶皂素的提取條件，確定料液比(X1)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)的零水平分別為 1∶8、50℃ 、50 min，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1和表2

表1 因素水平表

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由料液比、提取溫度、提取時(shí)間等3個(gè)因素對(duì)茶皂素提取效率相互作用所得結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)，根據(jù)多項(xiàng)式回歸方程Y=b0+∑biXi+∑bijXiXj+∑Xii2，按試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而得到回歸方程:Y=78.105 06+4.355 21X1+1.122 14X2+6.726 60X3－2.770 03X12－3.049 33－4.053 43－0.248 75X1X2－1.908 75X1X3－1.181 25X2X3

表3為試驗(yàn)結(jié)果的方差分析，由表3可知，回歸方程顯著性檢驗(yàn) F2=10.549 81＞F0.01(9，10)=4.94，回歸顯著，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好;失擬性檢驗(yàn)F1=3.244 77＜F0.05(5，5)=5.05，說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小，回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合。單因素中，僅溫度(X2)不顯著，其他幾個(gè)因素的分析均達(dá)到了顯著水平;剔出α=0.10的不顯著項(xiàng)后，建立提取率對(duì)試驗(yàn)因子的回歸方程:

2.4.1 單因素分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)單因素進(jìn)行效應(yīng)分析，結(jié)果見(jiàn)表4及圖4。

表4 單因素效應(yīng)分析

圖4 各單因素與茶皂素提取效率的關(guān)系

由表4和圖4可以看出，提取時(shí)間對(duì)茶皂素提取效率影響最大，其次是料液比，提取溫度對(duì)茶皂素提取效率影響最小。隨著提取時(shí)間的增加，茶皂素的提取效率也隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間的試驗(yàn)水平為1.000 0時(shí)，即提取60 min，茶皂素的提取效率達(dá)到最高。再延長(zhǎng)時(shí)間，茶皂素提取效率趨緩甚至略有下降，這是因?yàn)檫_(dá)到一定時(shí)間后，液相主體溶質(zhì)濃度增加，傳質(zhì)動(dòng)力減小，浸提速度下降，最終達(dá)到平衡狀態(tài)，再延長(zhǎng)提取時(shí)間茶皂素的提取效率增長(zhǎng)十分緩慢。

料液比對(duì)茶皂素提取效率的影響在試驗(yàn)水平1.000 0時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)料液比為1∶9。茶皂素的提取過(guò)程，即為茶皂素的溶出過(guò)程，理論上講，料液比越大，則液相主體的溶質(zhì)濃度低，傳質(zhì)推動(dòng)動(dòng)力越大，浸取速度增加，但是料液比增大，溶劑的用量加大，使溶劑回收或濃縮溶液的工作量加大，同時(shí)溶出的其他雜質(zhì)的機(jī)會(huì)也越多，因此要選擇合適的料液比。

隨著提取溫度的增加，茶皂素的提取效率逐漸增大，當(dāng)提取溫度的試驗(yàn)水平為0.000 0時(shí)，即溫度達(dá)到50℃時(shí)，茶皂素的提取效率達(dá)到最高。而后溫度再升高時(shí)，茶皂素提取效率則逐漸降低，主要原因是甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，提取液顏色加深，同時(shí)，溫度升高，溶液黏性增加，淀粉糊化速度加快，阻止了茶皂素的析出。

2.4.2 交互作用效應(yīng)分析

選取一個(gè)因素固定于零水平，考察另兩個(gè)因素的交互作用，分別作圖可以直觀地分析各因子間的互作效應(yīng)，結(jié)果分別見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 料液比(X1)與溫度(X2)的交互作用圖

圖6 料液比(X1)與時(shí)間(X3)的交互作用圖

圖7 溫度(X2)與時(shí)間(X3)的交互作用圖

圖5為料液比(X1)與溫度(X2)的交互作用圖，由圖5可知，在一定的提取濃度(X1)下，茶皂素的提取效率隨著溫度的增大而升高，當(dāng)達(dá)到最大值后，溫度(X3)的增加只會(huì)降茶皂素的提取效率，亦即溫度(X3)不宜過(guò)高，溫度(X3)過(guò)高甲醇易揮發(fā)，降低茶皂素的提取效率。同理，在一定的溫度(X3)下，料液比(X1)的增加也會(huì)提高茶皂素的提取效率，隨著料液比(X1)的增加，茶皂素的提取效率增長(zhǎng)趨于平緩。

圖6為料液比(X1)與時(shí)間(X3)的交互作用圖，由圖可知，提取時(shí)間(X3)在較高水平時(shí)，茶皂素的提取效率都比較高，而提取時(shí)間(X3)在較低水平時(shí)，茶皂素的提取效率雖然會(huì)隨著料液比(X1)的增加而增加，但與提取時(shí)間(X3)在高水平相比，仍然較低。在料液比(X1)一定的情況下，茶皂素的提取效率會(huì)隨著提取時(shí)間(X3)的延長(zhǎng)有明顯提高，但延長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，茶皂素提取效率反而略有下降，說(shuō)明提取時(shí)間(X3)對(duì)茶皂素的提取效率有很大影響。

圖7為溫度(X2)與時(shí)間(X3)的交互作用圖，由圖可知，在提取時(shí)間(X3)一定時(shí)，將提取溫度(X2)增加即可提高茶皂素的提取效率，但到達(dá)最高之后，茶皂素的提取效率會(huì)隨著溫度(X2)的升高而降低，而且在不同時(shí)間(X3)時(shí)，其變化趨勢(shì)是不同的，當(dāng)時(shí)間(X3)較短時(shí)，盡管隨著溫度(X2)的升高會(huì)增大茶皂素提取效率，但是變化較緩;而當(dāng)提取時(shí)間(X3)逐漸延長(zhǎng)，茶皂素提取效率隨提取溫度(X2)變化較為明顯;兩者的相互影響表明，選取適宜的提取溫度(X2)和時(shí)間(X3)可使茶皂素有較高提取效率。

2.5 提取工藝的優(yōu)化

由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，在試驗(yàn)中不但存在著單因素效應(yīng)，而且還有因素間的交互作用，因此很難從單因素效應(yīng)和交互作用的結(jié)果分析中找到最佳提取條件，并且三元二次回歸的數(shù)學(xué)模型不存在提取效率函數(shù)的極值，同時(shí)考慮到本試驗(yàn)中溫度不宜太高、時(shí)間不宜太長(zhǎng)等因素，因此需對(duì)回歸模型進(jìn)行再解析，本試驗(yàn)采用頻率分析法分析回歸模型以找到最佳提取條件，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，在95%的置信區(qū)間茶皂素提取效率大于71.36%各變量的取值區(qū)間分別為0.585～1.091、－0.341～0.341、0.708～1.123，即料液比為1∶8.6～1∶9.1、溫度為48.3～51.7℃、提取時(shí)間為57～61.2 min，在此范圍內(nèi)，考慮到實(shí)際的可操作性，可將最佳工藝條件定為:料液比為1∶9、溫度為50℃、提取時(shí)間為57 min，在此條件下預(yù)測(cè)值為81.08%，用此最優(yōu)提取條件對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，得茶皂素提取效率為80.89%，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明本試驗(yàn)結(jié)果擬合得出的回歸方程可以較好地應(yīng)用于茶皂素的提取。

表5 各變量取值的頻率分布

3 結(jié)論

(1)采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，以油茶餅為原料提取茶皂素，以影響茶皂素提取效率的料液比(X1)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)幾個(gè)因素為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，得到了三元二次數(shù)學(xué)回歸模型:Y=78.105 06+4.355 21X1+6.726 60X3－2.770 03－3.049 33－4.053 43。

(2)對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化可知，茶皂素提取效率大于71.36%的最優(yōu)提取條件為料液比1∶8.6～1∶9.1、溫度48.3～51.7℃、提取時(shí)間57～61.2 min，在此范圍內(nèi)，考慮到實(shí)際的可操作性，可將最佳工藝條件定為:料液比為1∶9、溫度為50℃、提取時(shí)間為57 min，此條件下茶皂素的實(shí)際提取效率為80.89%，與預(yù)測(cè)值81.08%較為接近，說(shuō)明數(shù)學(xué)模型對(duì)茶皂素的提取工藝是可行的。

［1］李升鋒，尹國(guó)，劉學(xué)銘，等.茶皂素性質(zhì)提取、精制及應(yīng)用［J］.糧食與油脂，2003(11):17－18.

［2］李運(yùn)濤，賈斌.茶皂素的提取工藝及其在洗滌劑中的應(yīng)用［J］.茶葉科學(xué)，2006，26(3):199－203.

［3］胡紹海，胡衛(wèi)軍.茶皂素在化學(xué)農(nóng)藥乳油劑中增效作用研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998(2):36－40.

［4］柳榮祥等.茶皂素生物活性應(yīng)用研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢(shì)［J］. 茶葉科學(xué)，1996，16(2):81－86.

［5］黃衛(wèi)文，敖常偉.油茶皂素抑菌研究［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2002，20(1):17－19.

［6］浦炳寅.茶皂素生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1999，11(5):55－59.

［7］胡紹海，胡衛(wèi)東.茶皂素在農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)油脂，1997，22(4):61－62.

［8］Mao H L，Wang J K，Zhou Y Y，et al.Effects of addition of tea saponins and soybean oil on methane production，fermentation and microbial population in the rumen of growing lambs［J］.Livestock Science，2010，129(1):56－62.

［9］Xia H L，Chi X Y，Yan Z J，et al.Enhancing plant uptake of polychlorinated biphenyls and cadmium using tea saponin［J］.Bioresource Technology，2009，100(20):4 649－4 653.

［10］Hu W L，Wu Y M，Liu J X，et al.Tea saponins affect in vitro fermentation and methanogenesis in faunated and defaunated rumen fluid［J］.Journal of Zhejiang University Science，2005，6B(8):787－792.

［11］楊德.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［12］賴富饒，吳暉.二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化豆皮水溶性多糖的提取工藝［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24(12):1 259－1 263.

［13］張可，錢(qián)和，張?zhí)?，?油茶餅粕中茶皂素提取工藝的研究［J］.食品科技，2003(10):68－70.

［14］錢(qián)仁淵，陳德軍，包宗宏.甲醇－6號(hào)溶劑-水混合溶劑浸提油茶籽油的研究［J］.中國(guó)油脂，2005，30(10):36－38.

［15］劉昌盛，黃鳳洪.超聲波法提取茶皂素的工藝研究［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2006，28(2):203－206.

［16］李靜，李燕.茶皂素的提取及純化研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(11):154－156.

［17］吳雪輝，張喜梅.茶皂素微波提取過(guò)程的優(yōu)化及數(shù)學(xué)描述［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37(4):125－129.

［18］郭輝力，鄧澤元.微波/光波輔助提取茶皂素的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008(11):168－170.

［19］侯如燕，宛曉春，黃繼軫.油茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的制備及定量方法的比較［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(8):62－65.

Optimization of the Extraction Process of Tea Saponin by Quadratic General Rotary Unitized Design

Nie Yun，Zhou Qian，Qu Xiao-qing，Li Ging-li，Ding Zhi-en
(College of Tea and Food Science Technology，Hefei 230036，China)

Based on the cake of camellia oleifera seeds as raw materials，the methanol as extraction agents，use quadratic general rotary unitized experimental design to optimize the process of ultrasonic-assisted extraction.Based on the single factor，solid-liquid ratio，extracting temperature and the time were selected as the test elements.The regression mathematics model with extraction efficiency of tea saponin as the target was established.The optimization extraction conditions was achieved through the results of variance analysis and mathematical model optimization.The results showed that the best condition for the ultrasonic-assisted extraction of the tea saponin is:solid-liquid ratio 1∶9，temperature 50℃，extracting for 57mins.Under this condition，the tea saponin extraction efficiency can reach to 80.89%.

tea saponin，quadratic general rotary unitized design，ultrasonic-assisted extraction

碩士研究生(丁之恩教授為通訊作者，E-mail:dingze@zhau.edu.cn)

*科技部“部分食用植物油脂加工關(guān)鍵技術(shù)及資源綜合利用”項(xiàng)目(2009GJC30030)

2010－08－11，改回日期:2010－10－20