鄧義熹,趙 劼,張亞雄,姚 鵑,李知洪

(1.三峽大學(xué)生物工程重點實驗室,湖北宜昌 443002; 2.安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003)

麥芽根提取5′-磷酸二酯酶對RNA酶解工藝研究

鄧義熹1,趙 劼2,張亞雄1,姚 鵑2,李知洪2

(1.三峽大學(xué)生物工程重點實驗室,湖北宜昌 443002; 2.安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003)

從麥芽根提取中的 5′-磷酸二酯酶,原酶液酶活達(dá)到 300U/mL。將提取的酶液用于水解酵母 RNA,得到5′-AMP、UMP、CMP、G MP四種核苷酸,并系統(tǒng)研究了麥芽根 5′-磷酸二酯酶對核酸的酶解條件。結(jié)果表明,最佳反應(yīng)條件為:底物濃度 3%,酶用量 5%,溫度 68℃,pH6.5,水解時間為 4～5h,在此條件下,酶解率可以達(dá)到 84%。在酶解 2h內(nèi)補加RNA底物可提高酶利用率。

麥芽根,5′-磷酸二酯酶,5′-核苷酸,酶解率

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥麥芽根 蘭州黃河啤酒廠;RNA底物 國藥集團化學(xué)試劑有限公司,生物試劑;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鉬酸銨、高氯酸、硫酸鎂、硫酸鋅 均為國產(chǎn)分析純。

恒溫水浴鍋 DKU-20型,上海精密儀器實驗設(shè)備公司;高速冷凍離心機 CR21G,日立公司;紫外可見分光光度計 UV-2082H,尤尼柯(上海)儀器有限公司;高效液相色譜儀 1200 安捷倫。

1.2 分析方法

1.2.1 酶活測定 采用紫外分光光度法,參照文獻(xiàn)[5],并略作修改。

1.2.2 四種核苷酸含量的測定 參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2582-2003。

1.2.3 干物質(zhì) (DS)測定 參照國標(biāo) GB/T5009.3 -2003。

1.2.4 總蛋白測定方法 參照國標(biāo) GB/T5009.5 -2003。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶提取方法 選取儲存于干燥通風(fēng)處的麥芽根,經(jīng)粉碎機粉碎后過 60目篩,按一定料液比加水,并加入 0.5mol/L MgSO4,特定溫度浸提 12h,浸提液離心后得上清即為粗酶液,測定酶活單位。

1.3.2 RNA水解工藝 稱取定量 RNA底物,溶于100mL去離子水,調(diào) pH至酶最適 pH,70℃水浴中保溫,預(yù)熱至恒溫后,按 20U/mL加入 5′-磷酸二酯酶粗酶液,反應(yīng) 4～5h。反應(yīng)完畢后,升溫至 90℃,保溫10min滅酶,冷卻離心,濃縮后測定四種核苷酸含量[7],計算酶解率,計算公式如下:

酶解率 =水解液中四種核苷酸含量 (g/kg)× RNA底物溶液干物質(zhì)濃度 (%)/水解液干物質(zhì)濃度(%)×RNA底物的濃度(g/kg)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解條件的研究

2.1.1 不同底物濃度對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響 分別配制 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%不同濃度 RNA底物溶液,68℃水解 5h后,測定水解液的核苷酸含量,計算酶解 RNA底物的酶解率。結(jié)果表明,提高 RNA底物濃度有利于酶解率的提高,但高濃度的 RNA底物濃度會抑制核酸酶 P1的作用,可以看出,隨著 RNA底物濃度的增加,酶解率也逐漸增加,但在一定的酶濃度情況下,繼續(xù)增加 RNA底物的濃度,由于相對酶濃度變小,酶解率也開始下降,RNA底物濃度為 5%時,酶解率最高達(dá)到 84%,底物濃度超過8%時,酶解率僅有 50%。

圖 1 不同濃度底物對酶解率的影響

2.1.2 不同 pH對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響分別配制 pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的RNA底物,在 68℃反應(yīng) 5h后,測定酶解液的核苷酸含量,計算酶解 RNA底物的酶解率。結(jié)果如圖 2, 5′-磷酸二酯酶在 pH5～7之間水解效果較好,其中pH6.5水解效果最好,酶解率達(dá)到 83%。pH低于 5或超過 7時,酶解效率明顯降低,這可能是由于偏堿或偏酸性的反應(yīng)環(huán)境會影響酶的構(gòu)象,影響 5′-磷酸二酯酶與 RNA底物結(jié)合[8],從而降低酶解速率,尤其當(dāng) pH大于 7時,酶解能力迅速下降,說明此酶對堿性環(huán)境非常敏感。

圖 2 pH對酶解率的影響

2.1.3 不同反應(yīng)溫度對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響 分別在 55、60、65、70、75、80℃水浴條件下做酶解實驗,5h后滅酶測核苷酸含量。5′-磷酸二酯酶是一種鋅酯酶,在鋅離子存在條件下,熱穩(wěn)定性很好,且酶促反應(yīng)溫度較高[9]。從圖 3可以看出,5′-磷酸二酯酶在溫度低于 65℃時水解 RNA能力較差;高于65℃后,隨著溫度的升高,水解能力顯著增強,在65～75℃之間達(dá)到最高值 83%;溫度繼續(xù)升高,酶解能力開始下降,這可能是由于溫度過高導(dǎo)致酶失活。

圖 3 水解溫度對酶解率的影響

2.1.4 不同反應(yīng)時間對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響 配制一定濃度的 RNA底物溶液,在 68℃進行酶解反應(yīng),每隔 1h取樣測定酶解液中的核苷酸含量,計算酶解率。結(jié)果如圖 4,酶解反應(yīng)在最初的 1h最快,1h時酶解率達(dá)到 70%,隨著水解的繼續(xù)進行,水解液的核苷酸得率繼續(xù)提高,但在3～4h后核苷酸含量基本不變,酶解率達(dá)到最高 82%。因此,為了確保高的水解率,選擇4h作為核酸水解的最佳工藝時間。

圖 4 反應(yīng)時間對酶解率的影響

2.1.5 不同加酶量對 5′-磷酸二酯酶水解效果的影響配制一定濃度的RNA底物,分別按3%、5%、8%、10%、15%、20%的比例添加酶活為 300U/mL的酶液,68℃水浴條件下反應(yīng) 4h滅活,測水解液核苷酸含量。通常,在酶促反應(yīng)中增加酶濃度有利于反應(yīng)向轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的方向進行,但在底物濃度一定的情況下,過高的酶濃度并不能一直提高反應(yīng)速率[10]。由圖 5可以看出,隨著 5′-磷酸二酯酶酶液使用量的增加,水解液中核苷酸含量也逐漸增加,當(dāng)原酶液添加量達(dá)到 10%時,提高酶量不能提高酶解率,此時酶促反應(yīng)達(dá)到最大速率。

圖 5 添加酶量對酶解率的影響

2.2 補加 RNA底物對最終酶解率的影響

在水解過程中,隨著反應(yīng)的進行,底物濃度逐漸降低,酶促反應(yīng)速率也相應(yīng)降低。反應(yīng)進行一段時間后補加一定量的底物是提高酶促反應(yīng)效率的有效方法。實驗中分別在酶解反應(yīng)進行到 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h時添加與初始底物濃度相等的 RNA底物,繼續(xù)水解到 5h后測定水解液中核苷酸含量,如圖 6,在不添加 RNA底物的情況下,水解反應(yīng)進行到2h后,水解產(chǎn)物中核苷酸含量達(dá)到最高水平,從圖 7可以看出,在 2h前添加相應(yīng)量的底物,水解率基本保持在 85%以上,隨著水解時間的延長,核酸酶開始失活,酶濃度降低,再添加底物并不能有效的提高總體的酶解得率。所以,在酶解反應(yīng)開始的 2h內(nèi)添加一定量的底物有利于酶解效率的提高。

圖6 補加RNA對酶解率的影響

2.3 兩種酶水解效果及性價比研究

配制 1g/100mL RNA水溶液 (RNA純度約為90%),分別加 0.08%的 5′-磷酸二酯酶“RP-1”(日本天野酶)和麥芽根提取原酶液 5%(V/V),在 68℃水解 4～5h,水解液 5000r/min離心 10min后,取上清液濃縮至一定倍數(shù),檢測水解濃縮液中的四種核苷酸含量及干物質(zhì)[7],計算酶解率。

由表 1可知,比較兩種酶解液中核苷酸含量表明,兩種 5′-磷酸二酯酶的酶解效果都較好,四種核苷酸含量基本相同,酶解率都達(dá)到 85%以上。另外,比較圖 7和圖 8可以看出,兩種酶解液中,雜峰都較低,峰型基本一致,這表明麥芽根提取 5′-磷酸二酯酶在核酸水解方面完全能夠達(dá)到天野酶的效果。

表 1 兩種酶的水解結(jié)果比較

圖7 HPLC測定“RP-1”酶水解RNA后四種核苷酸

圖 8 HPLC測定麥芽根提取 5′-磷酸二酯酶水解RNA后四種核苷酸含量

3 結(jié)論

3.1 從啤酒大麥麥芽根里提取 5′-磷酸二酯酶成本低,生產(chǎn)工藝簡單,提取酶活可以達(dá)到 300U/mL。

3.2 用 5′-磷酸二酯酶水解酵母 RNA生成 5′-核苷酸。綜合考慮放大生產(chǎn)成本,生產(chǎn)條件及產(chǎn)品風(fēng)味因素,相對調(diào)整各單因素實驗結(jié)果,因而采用底物濃度為 3g RNA/100mL溶液,酶用量為 5%(V/V),酶解溫度為 68℃,pH6.5,酶解時間 4～5h時,5′-核苷酸的酶解率達(dá) 84%。工業(yè)上為了提高酶的利用率,可在水解反應(yīng)前期 2h內(nèi)補加相應(yīng)量的 RNA底物。

3.3 麥芽根提取的 5′-磷酸二酯酶酶活穩(wěn)定,成本較低,可用于工業(yè)生產(chǎn)上降解酵母 RNA得到四種單核苷酸,用于食品添加劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

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Study on the process of RNA hydrolysis by 5′-phosphodiesterase extracted from barley rootlet

DENG Y i-xi1,ZHAO Jie2,ZHANG Ya-xiong1,YAO Juan2,L I Zhi-hong2
(1.KeyLaboratory ofBio-engineering,China Three GorgesUniversity,Yichang 443002,China; 2.Angel Yeast Co.,Ltd,Yichang 443003,China)

Extrac tion of5′-p hosp hod ies te rase from ba rley rootle t was conduc ted.The enzym e ac tivity ob ta ined was 300U/mL.W hen ribonuc le ic ac ids from yeas t we re d iges ted w ith the enzym e solution,4kinds of nuc leotides, 5′-AM P、UM P、CM P and GM P we re resulted.The op t im um cond itions for the reac tion we re as follows:concentra tion of subs tra te RNA3%,sum of enzym e solution5%(V/V),d iges tion temp e ra ture68℃,pH6.5,reac tion t im e4～5h, the yie ld of5′-nuc leotide a tta ined84%.The utiliza tion of the enzym e was ra ised by feed ing w ith RNA w ithin2h.

ba rley rootle t;5′-p hosp hod ies te rase;5′-nuc leotide;enzym e-deg rada tion ra te

TS201.3

A

1002-0306(2010)01-0207-03

5′-磷酸二酯酶廣泛存在于植物及動物臟器中,還可由微生物發(fā)酵獲得,此酶可用于降解酵母 RNA生產(chǎn)核苷酸。而核苷酸類物質(zhì)是重要的鮮味呈味來源[1],日本最早開始核苷酸類鮮味劑生產(chǎn),并于上世紀(jì) 60年代后期成為核苷酸類物質(zhì)的最大生產(chǎn)國。目前,核苷酸類物質(zhì)及其衍生物的應(yīng)用己遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出調(diào)味增鮮范圍,其在抗病毒和抗癌瘤的作用受到醫(yī)藥界的重視[2]。目前,生產(chǎn)核苷酸的方法主要有水解法、發(fā)酵法、化學(xué)法、酶促合成法、提取法和自溶法[3],其中,利用 5′-磷酸二酯酶水解核酸生產(chǎn)核苷酸是最簡便、最易控制的途徑,但由于食品級 5′-磷酸二酯酶在全球只有一家生產(chǎn)商 (天野特種酶制劑),因而價格奇高,是其他食品用酶的數(shù)倍,這也造成核苷酸類產(chǎn)品價格的居高不下。傳統(tǒng) 5′-磷酸二酯酶生產(chǎn)方法是桔青霉發(fā)酵培養(yǎng)[4],但工藝復(fù)雜,且霉菌孢子容易造成污染。麥芽根是啤酒大麥芽生產(chǎn)中的副產(chǎn)物,其中含有豐富的 5′-磷酸二酯酶[6]。因此,可從麥芽根中提取 5′-磷酸二酯酶。本文主要研究將從麥芽根中提取 5′-磷酸二酯酶用于酵母 RNA酶解生產(chǎn)5′-核苷酸,并通過改進和優(yōu)化酶解條件及工藝,提高酶解效率。

2009-11-11

鄧義熹 (1985-),男,碩士研究生,研究方向:微生物代謝工程。