陳雄英,王振煥,胡清華,鐘華,鄧峰美,何芳

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病重點實驗室,石河子832002;2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院/衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點實驗室,武漢430030)

細胞外鈣受體調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞游離鈣離子濃度的研究

陳雄英1,王振煥1,胡清華2,鐘華1,鄧峰美1,何芳1

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病重點實驗室,石河子832002;2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院/衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點實驗室,武漢430030)

為探討人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)游離鈣離子濃度是否受細胞外鈣受體(CaR)的調(diào)節(jié)。采用Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測CaR在 HUVEC中蛋白及mRNA表達。使用CaR激動劑精胺,負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231,通過鈣熒光探針(Fura-2/AM)負(fù)載 HUVEC檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)。結(jié)果顯示:(1)HUVEC中有CaR的表達。(2)在Fura-2/AM負(fù)載 HUVEC中加入精胺刺激,[Ca2+]i為△ratio=0.24±0.01,先加入Calhex231作用1min后再加入Calhex231+精胺刺激,[Ca2+]i為△ratio=0,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可知,CaR調(diào)節(jié) HUVEC游離鈣離子濃度。

細胞外鈣受體;Calhex231;細胞內(nèi)鈣離子濃度

Abstract:To study whether intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i)is regulated by Ca-sensing receptor(CaR)in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).CaR protein was demonstrated by Western blot.The mRNA expression of CaR was investigated by RT-PCR in HUVEC.The fluorescence Ca2+indicator Fura-2/AM was used to observe[Ca2+]iin the presence of CaR agonists spermine and negative allosteric modulator Calhex231.(1)CaR is present in HUVEC.(2)There was significantly difference in[Ca2+]ibetween spermine(△ratio=0.24 ±0.01)and Calhex231+spermine(△ratio=0)(P<0.05).CaR regulates[Ca2+]iin HUVEC.

Key words:calcium-sensing receptor;Calhex231;intracellular Ca2+concentration

鈣離子作為金屬離子并不象其它大分子可被表達和降解,其無論在細胞內(nèi)或細胞外執(zhí)行功能必須首先達到或維持一定濃度,而且在細胞內(nèi)外維持一定的濃度差。細胞內(nèi)鈣離子濃度可由各種信號分子、鈣泵及鈣離子通道等多種因素精確調(diào)控。其中包括由細胞外鈣受體(The extracellular Ca-sensing receptor,CaR)介導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣池釋放和電壓門控性鈣離子通道(Voltage-gated Ca2+channels,VOC)、受體操縱鈣離子通道(Receptor-operated channels,ROC)、及瞬時型感受器電位(transient receptor potential canonical,TRPC)通道等介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流[1,2]。有研究表明在人的臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中,激動劑ATP、組胺通過觸發(fā)細胞內(nèi)鈣池釋放激活小電導(dǎo)系數(shù)鈣敏感鉀通道(small-conductance,SKCa)和中電導(dǎo)系數(shù)鈣敏感鉀通道(intermediateconductance Ca2+-activated K+,IKCa),介導(dǎo)細胞膜超極化。而這種激動劑觸發(fā)的細胞內(nèi)鈣池釋放是否與激活 G蛋白偶聯(lián)受體有關(guān)尚不清楚[3],有待進一步研究。

CaR為 G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的成員,屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C亞族的成員,其基本結(jié)構(gòu)與一般 G蛋白偶聯(lián)受體相同,由1078個氨基酸組成[4]。該受體最早克隆于甲狀旁腺,在維持全身鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,通過感受細胞外Ca2+濃度(extracellular Ca2+concentration,[Ca2+]o)變化調(diào)節(jié)甲狀旁腺素(PTH)的分泌。當(dāng)[Ca2+]o升高時,激活 CaR經(jīng)磷脂酶 C(phospholipid lipoidase,PLC),增加胞內(nèi)三磷酸肌醇和二磷酸甘油,使細胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)升高、抑制PTH的分泌。

本研究以原代培養(yǎng) HUVEC為研究對象,通過鈣熒光探針(Fura-2/AM)負(fù)載 HUVEC檢測精胺與Calhex231+精胺共孵育時[Ca2+]i的變化。探討HUVEC游離鈣離子濃度是否受CaR的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

剖宮產(chǎn)健康胎兒的新鮮臍帶,性別、體重不限。

ECM培養(yǎng)基購自 Sciencellg公司,精胺、Calhex231為 sigma公司產(chǎn)品。CaR一抗為 Affinity Bioreagents產(chǎn)品。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗為Sigma產(chǎn)品。RNA提取用 Trizol,RTPCR試劑盒購自東盛科技。Fruo-2購自invitrogen公司。其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)原代及傳代培養(yǎng)

取剖宮產(chǎn)健康胎兒新鮮臍帶,以胰蛋白酶消化法培養(yǎng) HUVEC。胰蛋白酶注入臍靜脈內(nèi),室溫消化10 min后,10%FBS的M199培養(yǎng)基終止反應(yīng)。1000r/min,離心8min,ECM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細胞生長融合后,以104～105/mL的密度傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的2～5代細胞用于實驗。

1.3 細胞的蛋白樣品制備和Western blot檢測

棄去培養(yǎng)基,加入冷的0.01 mol/L PBS洗2次,加入100μL蛋白裂解液,細胞刮棒刮下貼壁細胞,將黏稠狀細胞裂解產(chǎn)物收集于eppendorf管中。冰浴中靜置30 min,12 000 r/min,4℃,離心5 min。將上清移入另一eppendorf管中,棄去沉淀。BCA方法蛋白定量。樣品置于加樣緩沖液中,沸水煮5 min,以 SDS-PAGE電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜(PVDF膜)上,室溫下用 5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1h。隨后加入CaR(1∶1 000)一抗,4℃孵育過夜。次日用 TBST緩沖液洗4次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶10 000),室溫輕搖1 h,TBST洗膜4次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,顯影定影處理,獲得實驗結(jié)果。

1.4 RT-PCR檢測

用 Trizol從 HUVEC中提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。體系含 Rnase Free H2O 6μL,5×RTBuffer4μL,dNTPMxituro2μL,Rnase inhibitor1 μL,oligo(dT)201μL,RNA 5μL,ReverTraAce1 μL。反應(yīng)條件:42℃,20 min;99℃,5 min;4℃,5 min。

PCR法檢測CaR mRNA的表達。上游引物:5′-GAA GTCGGGTATTACAACG-3′,下 游 引 物 :5′-GAGCAGGGAGAAGA GGAG-3′,擴增片段為459 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;30次循環(huán)(94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電泳條帶經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析后獲得實驗結(jié)果。

1.5 HUVEC[Ca2+]i的測定

將第2代或第3代 HUVEC接種于放有圓形玻片的六孔板中。待細胞達80%融合時,將玻片取出放入自制的灌流槽中,用含有2μmol/L Fura-2/AM的HBS(CaCl21.5 mmol/L,NaCl 140 mmol/L,KCl 5 mmol/L,HEPES 20 mmol/L,MgCl22 mmol/L,Glucose.H2O 10 mmol/L)溶液37℃孵育細胞15 min后,沖洗,并繼續(xù)用 HBS溶液孵育15～20 min使 Fura-2/AM去酯化。然后用 HBS溶液反復(fù)沖洗。

將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡(Olympus XI70)上,40倍鏡下調(diào)整細胞層面,用本實驗室自行研制的全自動顯微灌流控制系統(tǒng)來控制所加藥物灌流液的轉(zhuǎn)換。同時用340 nm與380 nm波長的激發(fā)光激發(fā)鈣離子熒光探針Fura-2發(fā)射熒光,用CCD拍攝熒光的動態(tài)變化并通過鈣熒光成像系統(tǒng) IPA software進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用 ˉx±S差表示,組間比較用單因素方差分析,均數(shù)間的比較采用 t檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC中CaR的表達

2.1.1 HUVEC中CaR蛋白表達

見圖1,可見100～130 ku CaR蛋白表達,2條帶均為目的蛋白。

2.1.2 HUVEC中CaRmRNA表達

見圖2,可見459 bp的CaRmRNA表達。

圖1 Western blot檢測CaR蛋白的表達Fig.1 The protein expression of CaR analyzed by Western blo t

2.2 精胺、Calhex231+精胺刺激下對HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

2.2.1 精胺刺激下HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加

Fura-2/AM負(fù)載 HUVEC后,用 Ca2+-free HBS溶液(EGTA 1 mmol/L,NaCl 140 mmol/L,KCl 5mmol/L,HEPES 20mmol/L,MgCl22 mmol/L,Glucose.H2O 10 mmol/L)檢測1 min后換Ca2+-free HBS配制的2 mmol/L的精胺持續(xù)灌流,大約8 min時[Ca2+]i濃度達最高峰,共檢測20 min[Ca2+]i(0.38±0.02)(0.62±0.01),n=3,P<0.05)。結(jié)果(圖3)顯示:精胺刺激下,HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加。

圖3 精胺刺激下HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化Fig.3 The change of[Ca2+]istimulated by spermine in HUVEC

圖2 RT-PCR檢測CaR mRNA的表達Fig.2 The mRNA expression of CaR analyzed by RT-PCR

2.2.2 Calhex231抑制精胺刺激下HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加

Fura-2/AM負(fù)載 HUVEC,Ca2+-free HBS溶液檢測1 min后,使用全自動顯微灌流控制系,用Ca2+-free HBS配制的 1μmol/L Calhex231將 Ca2+-free HBS溶液置換掉,繼續(xù)檢測1 min,再用 Ca2+-free HBS配制Calhex231+精胺(濃度同前)置換掉Ca2+-free HBS配制的Calhex231灌流20 min,[Ca2+]i(ratio 0.29±0.04 to 0.29±0.04,n=3,P<0.05),結(jié)果見圖4。比較圖4與圖3所得[Ca2+]i結(jié)果(△ratio=0.24±0.01與0,P=0.000),有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。這顯示:Calhex231明顯抑制精胺刺激下 HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。

圖4 Calhex231刺激下H UVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化Fig.4 The change of[Ca2+]istimulated by Calhex231 in HUVEC

3 討論

CaR具有廣泛宿主表達的特點,除了功能性表達于骨、腎、腸這3個主要的與鈣轉(zhuǎn)移和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)的器官外,CaR也廣泛分布于腦、皮膚、血管及內(nèi)皮細胞、心肌細胞等各種不同組織和細胞,通過PLC、磷脂酰肌醇激酶及促絲裂原活化蛋白激酶等細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起著除鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以外重要的細胞內(nèi)作用,如保護細胞抗凋亡,促細胞增殖、誘導(dǎo)細胞分化,促進激素分泌和離子通道激活等[4]。本研究證明HUVEC中有CaR的表達。

CaR可被不同的激動劑激活,其中 Ca2+、新霉素、釓及精胺等都可以作為配體來激活 CaR[5]。Ziegelstein RC等證實在人的主動脈血管內(nèi)皮細胞中有功能性的CaR表達,激動劑精胺刺激下,通過三磷酸肌醇和ryanodine敏感的鈣池釋放,可引起[Ca2+]i增加[6]。本研究證實HUVEC中有CaR表達,以激動劑精胺作為配體來激活CaR,發(fā)現(xiàn)在精胺的刺激下,HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加。但精胺并不是CaR特異性的激動劑。有研究表明Calhex231是一種新型的CaR負(fù)性變購調(diào)節(jié)劑[7],CaR激動劑Ca2+或calindol的增加,可引血管平滑肌細胞去極化,而這種去極化的效應(yīng)可被 Calhex231抑制[8]。本研究在負(fù)性變購調(diào)節(jié)劑 Calhex231作用 HUVEC后,再用精胺刺激。結(jié)果表明,Calhex231明顯抑制精胺刺激下 HUVEC細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。充分證明 HUVEC中游離鈣離子濃度受CaR的調(diào)節(jié)。

血管系統(tǒng)中的一氧化氮(nitric oxide,NO)等舒血管物質(zhì)的生成與血管內(nèi)皮細胞中細胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。生理條件下,NO主要源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),而eNOS-NO信息系統(tǒng)的健全又是內(nèi)皮細胞發(fā)揮生理作用的關(guān)鍵,內(nèi)皮細胞的正常與否直接關(guān)系到血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的研究,可能對深入了解血管生理和病理生理起著重要的作用。再者細胞內(nèi)游離鈣離子濃度維持與內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流的調(diào)節(jié)有關(guān),CaR在此相互關(guān)聯(lián)的兩個過程中的作用和機制有待進一步的研究。

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Extracellular Ca-sensing Receptor Regulating Intracellular Ca2+Concentration in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

CHEN Xiongying1,WANG Zhenghuang1,HU Qinghua2,ZNONG Hua1,DENG Fengmei1,HE Fang1
(1 Medical College,Shihezi University/Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China;2 Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology/Key Laboratory of Pulmonary Disease of Ministry of Health of China,Wuhan 430030,China)

R363.272

A

1007-7383(2010)04-0453-04

2009-10-11

國家自然科學(xué)基金項目(30860099)

陳雄英(1983-),女,碩士生,專業(yè)方向為心血管病理生理研究。

何芳(1964-),女,教授,從事心血管病理生理研究;e-mail:FangF2002shz@126.com。