周瑞平，陳云宗，唐代云

(四川省宜賓市敘府酒業(yè)有限公司技術(shù)中心，四川 宜賓 644000)

多糧濃香型白酒廠內(nèi)細(xì)菌多樣性及分布的研究

周瑞平，陳云宗，唐代云

(四川省宜賓市敘府酒業(yè)有限公司技術(shù)中心，四川 宜賓 644000)

采用改良的NA培養(yǎng)基分離、去除冗余，從多糧濃香型酒廠內(nèi)的空氣、曲藥、糟醅、窖泥中分離到82株細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌24株，占分離所得細(xì)菌總數(shù)的29.27%。對(duì)這24株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的16S rDNA序列分析表明，其中13株為Bacillus屬，9株分屬于Lysinibacillus屬、Staphylococcus屬、Rummeliibacillus屬，Brevibacillus屬、Brachybacterium屬，還有2株菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中模式菌株相似性低于97%，很可能代表著新類群。入窖糟醅中細(xì)菌種類及數(shù)量最多，曲藥中產(chǎn)芽孢細(xì)菌最多，可產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌在生產(chǎn)環(huán)境中分布最廣，表明細(xì)菌種類及數(shù)量的分布與白酒生產(chǎn)以及酒體的風(fēng)格形成可能有著密切的聯(lián)系。

多糧濃香型；細(xì)菌；分離；16S rDNA；分析

多糧濃香型白酒的生產(chǎn)離不開當(dāng)?shù)鬲?dú)特的自然環(huán)境，宜賓作為中國(guó)酒都，地處三江交匯處，其特殊的氣候環(huán)境孕育出了獨(dú)特的釀酒微生物生態(tài)區(qū)系；一般認(rèn)為在濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中，霉菌主要起糖化作用，酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精，細(xì)菌主要參與形成白酒復(fù)雜的風(fēng)味和香氣。雖然目前濃香型白酒釀酒微生物的研究已有較多報(bào)道[1-2]，但主要集中于功能細(xì)菌的分離、分布及產(chǎn)物利用[3-4]，而且其分類主要是根據(jù)其產(chǎn)物來(lái)判斷。同時(shí)，因?yàn)槟承┎豢膳囵B(yǎng)微生物在釀造過(guò)程中可能也起著重要作用[5]，近年來(lái)利用免培養(yǎng)法研究窖泥及糟醅中微生物區(qū)系分布有所報(bào)道[6]。但結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐的理論研究相對(duì)滯后，影響了白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)利用純培養(yǎng)的方法對(duì)多糧濃香型白酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌開展研究，希望對(duì)濃香型白酒釀造過(guò)程中主要細(xì)菌區(qū)系的變化有一個(gè)比較細(xì)致的了解，以探討多糧濃香型白酒釀造中多種細(xì)菌對(duì)白酒質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集：窖泥及糟醅選取同一車間產(chǎn)酒質(zhì)量及產(chǎn)酒率較優(yōu)、中等、較差且相對(duì)穩(wěn)定的3口窖取樣。曲藥為自制小麥大曲。

窖泥樣品：出窖時(shí)取分別于上中下層4點(diǎn)、底層中央取窖泥100g，每口窖單獨(dú)混合，采集后馬上回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

糟醅樣品：入窖及出窖時(shí)分別于每口窖內(nèi)上中下層糟醅同一平面上的中心及四周共15個(gè)取樣點(diǎn)各取樣100g，每口窖出窖樣品、入窖樣品單獨(dú)混合，采集后立即回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

曲藥樣品：取質(zhì)量不同(優(yōu)、中、差，初步判斷，后期通過(guò)產(chǎn)酒狀況進(jìn)一步證實(shí))、儲(chǔ)存時(shí)間(新曲、儲(chǔ)存3個(gè)月、儲(chǔ)存半年以上)不同的大曲樣品6個(gè)，分離其中細(xì)菌。

空氣樣品：采用自然沉降法取樣，取樣平板暴露在空氣中5min，按奧梅梁斯基公式換算為單位體積空氣中的細(xì)菌濃度[7]：n=50000×N/(A×t)，式中，n為大氣微生物濃度/(CFU/m3)；N為平板菌落數(shù)/(CFU/平皿)；A為平皿面積/cm2；t為平皿暴露于空氣中的時(shí)間/ min；50000為單位體積空氣中的細(xì)菌濃度的經(jīng)驗(yàn)值。

1.2 分離培養(yǎng)基

改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：1000mL NA培養(yǎng)基中含100mL由酒糟、曲藥浸提所得的浸提液及50000U制霉菌素。浸提液為50g酒糟或曲藥加500mL水煮沸后四層紗布過(guò)濾后所得。

1.3 試劑與儀器

菌株DNA提取、16S rDNA片段擴(kuò)增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TC-412 PCR儀 英國(guó)Techne公司；celdocxR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 細(xì)菌的分離及保藏

分別取各樣品100g溶于900mL無(wú)菌水中(實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水，滅菌，下同)中，梯度稀釋至10－4，每一稀釋梯度涂布10個(gè)分離平板。定期觀察分離平板，挑取單菌落劃線純化于常規(guī)NA斜面上。對(duì)從同一樣品內(nèi)分離到的菌株，如果菌落顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否、氣味、透明度、鏡下形態(tài)、排列方式等特征完全一致，則合并去除冗余。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)稀釋到10－3時(shí)，分離平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落已很少，且10－3梯度與10－2梯度的菌落數(shù)量差異主要由少數(shù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌引起，因此在本實(shí)驗(yàn)中確定每克樣品中菌落總數(shù)超過(guò)102CFU的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，同時(shí)對(duì)可形成某些產(chǎn)物提高酒質(zhì)或可能致病的細(xì)菌，予以特別關(guān)注。

1.5 培養(yǎng)物DNA提取和16S rDNA PCR擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[8]提供的方法，提取優(yōu)勢(shì)菌及特殊菌基因組DNA后，PCR擴(kuò)增16S rDNA。細(xì)菌引物27f：5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′和1541r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′[9]。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照東秀珠等[10]的方法進(jìn)行(PCR擴(kuò)增時(shí)退火溫度57℃，延伸時(shí)間50s，25個(gè)循環(huán))。

1.6 16S rDNA部分序列分析

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度1000～1100bp，所得序列用EzTaxon server 2.0[11]在線進(jìn)行相似性分析。用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，采用Kimura-2[12]計(jì)算核苷酸差異值，并用BioEdit 5.0.9進(jìn)行檢驗(yàn)，最后用Neighbor-Joining法[13]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展數(shù)(bootstrap)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀造環(huán)境中細(xì)菌的分布

表1 白酒釀造細(xì)菌分離情況Table 1 Distribution of bacteria during the production of Luzhouflavor liquor

從糟醅、曲藥、空氣、窖泥中一共分離得到82株細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌24株，占分離總數(shù)的29.27%。從分離結(jié)果來(lái)看，入窖糟醅中分離到的細(xì)菌種類和數(shù)量均最多，一方面因?yàn)槿虢言沲沁B接窖內(nèi)外環(huán)境的媒介，既包含了來(lái)自曲藥中的細(xì)菌，也包含了空氣、環(huán)境中附著的細(xì)菌；另一方面，入窖糟醅營(yíng)養(yǎng)豐富、濕度大，適宜好氧細(xì)菌及兼性厭氧細(xì)菌附著、生長(zhǎng)。因此入窖糟醅不僅可為窖池內(nèi)微生物的生長(zhǎng)繁殖補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)，而且還向窖內(nèi)接種了大量新的細(xì)菌，更新了窖內(nèi)菌群，保證了窖內(nèi)細(xì)菌菌群的動(dòng)態(tài)平衡。入窖糟醅中分離到的細(xì)菌數(shù)量及種類多于出窖糟醅及窖泥，說(shuō)明在窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中部分細(xì)菌因不能適應(yīng)窖內(nèi)環(huán)境而不能存活，導(dǎo)致不能在出窖糟醅中分離到這些細(xì)菌。出窖糟醅中的細(xì)菌又多于窖泥中的細(xì)菌，可能是因?yàn)樵沲瑺I(yíng)養(yǎng)比窖泥更豐富，且其氧化還原電位高于窖泥，部分好氧菌也能存活。

窖泥中優(yōu)勢(shì)菌少，因?yàn)榻涯嘀械臓I(yíng)養(yǎng)來(lái)自糟醅和黃水，成分復(fù)雜，含量均不高，很難富集某一類細(xì)菌，再加上窖泥環(huán)境波動(dòng)小，高酸及兼性厭氧，甲烷菌、己酸菌等厭氧細(xì)菌在其中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的馴化形成了相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)菌群落，多種屬細(xì)菌在長(zhǎng)期的合作、馴化過(guò)程中形成了相對(duì)穩(wěn)定、相互依存的群落關(guān)系，其中一些細(xì)菌很難通過(guò)平板分離得到純培養(yǎng)，因此分離得到的細(xì)菌種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于實(shí)際，優(yōu)勢(shì)菌也僅有兩種，說(shuō)明純培養(yǎng)法用于研究窖泥微生物存在一定局限性，尚需結(jié)合免培養(yǎng)法對(duì)其進(jìn)行深入研究，這也從一個(gè)側(cè)面證明難以通過(guò)簡(jiǎn)單地接種幾種細(xì)菌復(fù)制名廠老窖窖泥，生產(chǎn)出同等質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)白酒。

曲房空氣及曲藥中分離到的細(xì)菌種類都較少，但優(yōu)勢(shì)菌所占比例超過(guò)1/3，因?yàn)橹魄^(guò)程中曲房?jī)?nèi)溫度濕度都較高，曲藥品溫可達(dá)70℃以上，多數(shù)細(xì)菌不能耐受這樣的高溫，分離到的細(xì)菌均為耐高溫的產(chǎn)芽孢細(xì)菌。

窖房空氣中分離到的細(xì)菌菌株數(shù)較多，但僅有18%的優(yōu)勢(shì)菌，可能是因?yàn)榭諝庵械臓I(yíng)養(yǎng)和環(huán)境不能滿足大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需，空氣中的細(xì)菌多數(shù)來(lái)自于廠區(qū)生產(chǎn)環(huán)境，少數(shù)也可經(jīng)風(fēng)或進(jìn)入廠區(qū)的交通工具、工人帶入，隨空氣的流動(dòng)在曲房或窖房?jī)?nèi)短暫停留，因此曲房及窖房空氣中的細(xì)菌菌群不如糟醅、窖泥中的菌群穩(wěn)定。

2.2 濃香型白酒釀造細(xì)菌的種屬分布

表2 24株細(xì)菌與模式菌株的16S rDNA對(duì)應(yīng)序列相似性比對(duì)Table 2 Alignment of 16S rDNA gene sequences between 24 selected bacterial strains and their corresponding typical strains

對(duì)24株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，共得到24條有效序列(全部在GenBank注冊(cè)，序列號(hào)見(jiàn)表2)。一般情況下，16S rDNA序列相似性在98%以上的可以認(rèn)為是同種，97%以上可以認(rèn)為是同屬[15]，序列相似性小于96%～97%的可以認(rèn)為是不同種，小于93%～95%的可以認(rèn)為是不同屬[16]，從24株細(xì)菌16S rDNA部分序列與GenBank中菌株對(duì)應(yīng)序列的比較結(jié)果來(lái)看，這些細(xì)菌中的16株菌與分屬于5個(gè)屬10個(gè)種的模式菌株對(duì)應(yīng)序列相似度大于98%，據(jù)此可將這24株菌中的16株菌歸屬到4個(gè)屬的10個(gè)種，其中12株分屬于Bacillus屬的8個(gè)種，包括屬于Bacillus subtilis的2株、Bacillus amyloliquefaciens的1株、Bacillus drentensis的1株、Bacillus stratosphericus的1株、Bacillus anthracis的3株、Bacillus safensis的1株、Bacillus cereus的1株，Bacillus vallismortis的2株；與模式菌株Bacillus anthracisATCC14578對(duì)應(yīng)序列相似性大于98%的3株菌平板培養(yǎng)未見(jiàn)產(chǎn)莢膜，可見(jiàn)并非致病種。兩株屬于Lysinibacillus fusiformis，1株屬于Rummeliibacillus pycnus；1株屬于Staphylococcus gallinarum。對(duì)應(yīng)序列與模式菌株相似性在97%～98%之間6株菌僅能劃分到屬，分別是屬于Bacillus屬的兩株，屬于Staphylococcus屬、B r e v i b a c i l l u s屬、L y s i n i b a c i l l u s屬、Brachybacterium屬的各1株。對(duì)應(yīng)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中菌株最高相似性在96%～97%的兩株菌可認(rèn)為是分屬于Bacillus屬、Brevibacillus屬的兩個(gè)新種(表2)，但圖1中顯示，編號(hào)為xfru1的細(xì)菌雖然與數(shù)據(jù)庫(kù)中模式菌株最高相似性為96.97%，但一般認(rèn)為95%以下肯定為不同屬，95%～97%之間有可能為同屬不同種，結(jié)合圖1的系統(tǒng)發(fā)育圖來(lái)看，推測(cè)該株菌可能仍是Bacillus屬的一個(gè)新種或亞種，有待進(jìn)一步深入研究。編號(hào)xfru16的細(xì)菌與模式菌株Brevibacillus borstelensisNRRL NRS-818T對(duì)應(yīng)序列相似性為96.61%，且其在系統(tǒng)發(fā)育圖上距離模式菌株較近，有可能是Brevibacillus屬內(nèi)的新種。

曲藥中分離得到的4株細(xì)菌，有兩株屬于短芽孢桿菌Brevibacillus屬，其16S rDNA序列分別與該屬中兩個(gè)種的典型菌株序列最為接近，另外兩株菌的序列分別與Lysinibacillus屬及Bacillus屬內(nèi)的一個(gè)模式菌株對(duì)應(yīng)序列相似性最高，且相似性均在97%以上，所以此兩株菌可能分屬于Lysinibacillus屬及Bacillus屬。所以，曲藥中分離出的4株細(xì)菌均為產(chǎn)芽孢細(xì)菌，可能屬于3個(gè)屬中的4個(gè)種，這與產(chǎn)芽孢細(xì)菌能夠耐受制曲高溫有關(guān)。

入窖糟醅中分離到的細(xì)菌最多，其中9株優(yōu)勢(shì)菌及1株疑似致病菌均為產(chǎn)芽孢桿菌，5株細(xì)菌的16S rDNA部分序列與Bacillus屬的4個(gè)種的典型菌株的序列最為相似(均大于98%)，所以此5株菌屬于Bacillus屬；兩株的序列分別與Lysinibacillus屬、Rummeliibacillus屬中的兩個(gè)種典型菌株的序列相似性超過(guò)98%，可認(rèn)為分屬于Lysinibacillus屬及Rummeliibacillus屬。所以入窖糟醅中分離得到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分屬于Bacillus屬、Rummeliibacillus屬、Lysinibacillus屬及未確定屬的8個(gè)種。

圖1 24株白酒釀造細(xì)菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 16S rDNA phylogenetic tree of 24 selected bacterial strains during the production of Luzhou-flavor liquor

出窖糟醅中分離得到的4株細(xì)菌中的3株與3個(gè)模式菌株對(duì)應(yīng)序列的相似度超過(guò)99%，可認(rèn)為其分布屬于Bacillus stratosphericus、Bacillus subtilis、Bacillus anthracis3個(gè)種，其中與Bacillus anthracis相似性最高的一個(gè)種已確認(rèn)為非致病菌，1株菌與Ba c ill u s licheniformis對(duì)應(yīng)序列相似性為97.21%，可確定為Bacillus屬。

曲房空氣中分離得到3株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌其中的兩株與Staphylococcus屬中兩個(gè)種模式菌株對(duì)應(yīng)序列相似性均在97%以上，可認(rèn)為是該屬的兩個(gè)種。有1株與模式菌株Bacillus amyloliquefaciensATCC 23350對(duì)應(yīng)序列相似性超過(guò)99%，可認(rèn)為就是解淀粉芽孢桿菌。

窖房空氣中分離得到的兩株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與模式菌株Bacillus anthracisATCC 14578對(duì)應(yīng)序列相似性超過(guò)98%，可認(rèn)為是同屬菌株。

2.3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌釀造特性分析

Bacillus屬產(chǎn)芽孢細(xì)菌是大量存在于空氣、土壤、水等自然環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，此次分離所得的24株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中屬于該屬的細(xì)菌最多，包括8個(gè)種12株，分布于窖泥、糟醅、曲藥、空氣中(圖1)，數(shù)量和種類均多于其他環(huán)境中分離得到的Bacillus屬細(xì)菌，說(shuō)明該屬細(xì)菌在釀造環(huán)境中存在最廣，與濃香型白酒生產(chǎn)的關(guān)系最密切：一方面該屬的多個(gè)種可產(chǎn)淀粉酶或蛋白酶，糟醅、曲藥等釀造基質(zhì)能夠滿足其生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)條件，另一方面其細(xì)胞壁中脂質(zhì)含量低，對(duì)酒廠高濃度的乙醇、乙酸環(huán)境適應(yīng)較好。

其次是分屬于Lysinibacillus屬的兩個(gè)種的4株細(xì)菌，該屬細(xì)菌曾在水中、土壤及多種植物內(nèi)分離到，值得注意的是曲藥、入窖糟醅、窖泥中各發(fā)現(xiàn)1株與Lysinibacillus fusiformis模式種對(duì)應(yīng)序列相似性最高的細(xì)菌，該模式種不分解淀粉，也不能利用半乳糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸，這與通常認(rèn)為的白酒釀造細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)酸等性能相去甚遠(yuǎn)，推測(cè)這類細(xì)菌能夠耐受制曲過(guò)程中的高溫，并由曲藥接種到入窖糟醅和窖泥中，在此過(guò)程中可能會(huì)參與合成一些與濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的一些物質(zhì)。

在曲藥中分離到兩株Brevibacillus屬細(xì)菌曾在多種環(huán)境中分離到，嚴(yán)格好氧，曾報(bào)道該屬的一些種可產(chǎn)甘露聚糖酶，淀粉酶等，對(duì)多種動(dòng)植物病原真菌有明顯抑制作用，推測(cè)出現(xiàn)在曲藥中的這兩株Brevibacillus屬細(xì)菌可能在制曲過(guò)程中對(duì)曲藥菌群有一定程度的選擇作用。

從出窖糟醅中分離到1株Rummeliibacillus屬細(xì)菌，該屬細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性，兼性好氧，可在多處自然環(huán)境分離到，但目前對(duì)該屬細(xì)菌的相關(guān)研究主要是理論研究[16]，其產(chǎn)物特征還有待進(jìn)一步分析。Staphylococcus屬細(xì)菌廣泛存在于個(gè)種環(huán)境中，但筆者僅在空氣中分離到兩個(gè)非致病種，1株為雞葡萄球菌，1株為腐生葡萄球菌，曲藥、糟醅及窖泥中都未發(fā)現(xiàn)，推測(cè)這兩株菌與白酒釀造沒(méi)有必然聯(lián)系。

從產(chǎn)物特征來(lái)看，此次分離所得的24株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，經(jīng)平板實(shí)驗(yàn)可產(chǎn)淀粉酶的有13種，無(wú)論是種類還是數(shù)量都在分離環(huán)境中的細(xì)菌菌群中占優(yōu)勢(shì)，其次是耐乙醇、耐熱、產(chǎn)酸的細(xì)菌亦較為常見(jiàn)，如曲房空氣中分離到1株與模式菌株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensATCC 23350對(duì)應(yīng)序列相似度98%以上的優(yōu)勢(shì)菌，入窖糟醅中分離到1株與模式菌株死亡谷芽孢桿菌Bacillus vallismortisDSM 11031對(duì)應(yīng)序列相似度98%以上的優(yōu)勢(shì)菌，該屬細(xì)菌可水解淀粉，還可利用蔗糖、半乳糖、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖產(chǎn)酸；出窖糟醅中分離到1株與枯草芽孢桿菌模式菌株Bacillus subtilissubsp. NBRC 13719相似度99%以上的菌株，可認(rèn)為就是枯草芽孢桿菌，另有1株與地衣芽孢桿菌模式菌株B a c i l l u s licheniformisATCC 14580相似度97%以上的菌株可認(rèn)為是同屬。

總體來(lái)看，能產(chǎn)淀粉酶、有機(jī)酸且耐乙醇、耐熱的各種細(xì)菌在釀造環(huán)境中占較大優(yōu)勢(shì)，這與大曲或糟醅多年以來(lái)對(duì)環(huán)境細(xì)菌的選擇性富集有關(guān)。一般濃香型白酒的生產(chǎn)，酒醅的pH值在第2周或第3周表現(xiàn)出明顯上升，之后逐漸緩慢下降到3.5左右，大分子物質(zhì)粗淀粉、粗蛋白的大量降解基本上在第1周就已從入窖時(shí)的18%～21%下降到9%～12%，已接近降解下限；酒精發(fā)酵的主發(fā)酵在前3周已完成[17]?？梢?jiàn)白酒生產(chǎn)3周之前主要是由大曲中的糖化酶來(lái)分解淀粉，酵母菌轉(zhuǎn)化糖生成酒精，之后長(zhǎng)達(dá)7周的發(fā)酵時(shí)間則主要是決定白酒品質(zhì)的多種風(fēng)味物質(zhì)的形成，在這些風(fēng)味物質(zhì)生成和轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，細(xì)菌起著主要作用。以出窖糟醅中細(xì)菌為例，發(fā)酵后期細(xì)菌糟醅中粗淀粉含量為2%～10%，且含量穩(wěn)定，基質(zhì)酸度較高，5%乙醇左右時(shí)產(chǎn)淀粉酶、有機(jī)酸且耐乙醇的細(xì)菌所占比例明顯超過(guò)了其他分離樣品中的此類細(xì)菌，可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵末期，此類能夠分解淀粉的細(xì)菌更能適應(yīng)糟醅中糖類營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境，分解淀粉維持生存的同時(shí)，其產(chǎn)物還能為其他細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)或代謝前體物質(zhì)，直接或間接地參與白酒風(fēng)味物質(zhì)的生成，并逐漸在群體中成為優(yōu)勢(shì)菌。在生產(chǎn)過(guò)程中取樣發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后期溫度上升到40℃左右，酒精度仍有所上升，這一階段酵母因溫度上升、還原糖下降等因素生成乙醇的作用已經(jīng)很小，但細(xì)菌仍可正常生長(zhǎng)，繼續(xù)分解淀粉，供少量存活的酵母發(fā)酵形成乙醇。徐學(xué)明等[18]的研究表明在丟糟中加入糖化酶及活性干酵母可釀出中等質(zhì)量的白酒，而細(xì)菌可持續(xù)不斷地產(chǎn)糖化酶，說(shuō)明在釀造過(guò)程中，細(xì)菌除參與形成濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)之外，還可能起著提高酒精度的作用。

此次分離到的24株優(yōu)勢(shì)菌中的兩株菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中模式菌株對(duì)應(yīng)序列的相似性小于97%，代表著新的分類單位，可能是因?yàn)槲覈?guó)獨(dú)特的濃香型白酒釀造環(huán)境中存在一些特殊的細(xì)菌種屬，因此有必要對(duì)這兩株菌開展進(jìn)一步研究。此外，即使是與數(shù)據(jù)庫(kù)中模式菌株對(duì)應(yīng)序列的相似性大于97%的細(xì)菌，由于長(zhǎng)期選擇馴化，也可能跟已報(bào)道的同種屬細(xì)菌存在較大差異，如從窖泥中分離到的1株Brachybacterium屬細(xì)菌，已發(fā)現(xiàn)的該屬細(xì)菌皆為好氧，不耐酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可代謝葡萄糖和一些其他糖產(chǎn)酸。窖泥的高酸、兼性厭氧環(huán)境通常是不利于該屬細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的，但這株非產(chǎn)芽孢細(xì)菌作為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌從窖泥中分離到說(shuō)明這株細(xì)菌與該屬其他細(xì)菌存在較大差異，可能是Brachybacterium屬的一個(gè)新種，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 討 論

通常認(rèn)為環(huán)境中存在大量不可培養(yǎng)微生物，通過(guò)人工培養(yǎng)的方法很難培養(yǎng)出某一環(huán)境中的所有細(xì)菌，但白酒糟醅及窖泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)較為簡(jiǎn)單，一般的培養(yǎng)基能夠滿足，而且細(xì)菌間的相互作用主要也是通過(guò)糟醅、曲藥等媒介進(jìn)行的，在分離過(guò)程中加入了糟醅及曲藥的混合浸提液，分別在好氧及兼性厭氧的環(huán)境下分離培養(yǎng)，保證了大部分細(xì)菌，尤其是那些在群體中占優(yōu)勢(shì)的、與白酒釀造關(guān)系密切的細(xì)菌被分離出來(lái)。

16S rDNA由于具有許多的優(yōu)點(diǎn)，做為當(dāng)今生物系統(tǒng)發(fā)育的主要分子標(biāo)尺，但其也存在偏保守和可能存在多操縱子等問(wèn)題。已經(jīng)有許多研究結(jié)果表明有些16S rDNA序列相似性大于97%的菌株仍然屬于不同的分類類群[14]。所以，僅用16S rDNA序列信息是無(wú)法將菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定的，尚需結(jié)合多種生理生化指標(biāo)檢測(cè)及BOX-PCR、全序列雜交等遺傳指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。但是，利用16S rDNA序列分析對(duì)大量的快速菌株進(jìn)行初步鑒定是目前研究細(xì)菌多樣性主要使用的方法。

從本研究結(jié)果來(lái)看，細(xì)菌在白酒釀造的不同階段所起的主要作用不同，曲藥中的細(xì)菌主要以能耐高溫的產(chǎn)芽孢細(xì)菌為主。在制曲過(guò)程中，曲藥最高溫度可達(dá)70℃，超過(guò)了絕大多數(shù)酵母和霉菌所能耐受的最高溫度，但細(xì)菌則不然，已從曲藥中分離到了耐72℃高溫的細(xì)菌，可見(jiàn)曲藥中存活的微生物主要是細(xì)菌；另一方面，入窖糟醅經(jīng)過(guò)蒸煮，糧食中附著的微生物已經(jīng)死亡，在混曲混糟然后發(fā)酵的過(guò)程中引入的微生物來(lái)自于4個(gè)途徑：曲藥、空氣、紅糟、窖泥。紅糟及窖泥均來(lái)自窖內(nèi)，所以窖外微生物主要就是通過(guò)曲藥及空氣引入?？諝庵械恼婢咦尤虢押笤诮褍?nèi)氧氣稀薄的環(huán)境下很難萌發(fā)[19]，糖化作用主要是靠曲藥中的糖化酶而不是活的真菌來(lái)進(jìn)行。而細(xì)菌代謝類型多樣，所需營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，可適應(yīng)多種環(huán)境性，是在釀造環(huán)境中分布最廣最穩(wěn)定的微生物，尤其是Bucillus屬細(xì)菌存在種類和數(shù)量最多[4,20]，從多方面影響著白酒的質(zhì)量。

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Diversity and Distribution of Bacteria in Luzhou-flavor Wine Factory

ZHOU Rui-ping，CHEN Yun-zong，TANG Dai-yun
(Technical Center, Xufu Liquor Industry Co. Ltd., Yibin 644000, China)

Totally 82 bacterial strains were separated from air, koji, grain stuff and pit mud in Luzhou-flavor wine factory using improved NA medium, of which 24 were the dominant strains, accounting for 29.27% of the total number. According to the 16S DNA sequence analysis, the 24 strains comprised 13 belonging to the genusBacillus, 9 belonging to the generaLysinibacillus,Staphylococcus,Rummeliibacillus,BrevibacillusorBrachybacteriumand 2 presumed to be new species belonging to the generaBacillusorBrevibacillusdue to less than 97% similarity in 16S rDNA gene sequence compared with type strains from database. Meanwhile, most species and population of bacteria were observed in grain stuffs prepared for fermentation and endosporebearing bacteria were observed in koji. However, amylase-producing bacteria were distributed in manufacturing environment. These findings suggest that the distribution of bacterial species and their number appears to exhibit a significant effect on the manufacturing of liquor and favor formation of wine.

luzhou-flavor liquor；bacteria；separation；16S rDNA；distribution

TS261.1；TS262.3

A

1002-6630(2010)13-0209-05

2009-11-22

四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(09ZZ039)；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2009JY0149)；宜賓市自主創(chuàng)新專項(xiàng)(200905207)

周瑞平(1975—)，男，工程師、高級(jí)技師，本科，主要從事釀酒微生物、釀酒工藝研究。E-mail：xufu9@126.com